液相色谱-质谱联用技术在中药复方分析中的应用

朱鹤云，关 皎 (吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

中药复方指由两味或两味以上药味组成，具有相对规定性的加工方法和使用方法，针对相对确定的病证而设的方剂，其特点为多组分、多靶点同时作用，达到整体协同作用的结果［1］。中药复方复杂体系的成分分析，是中药现代化研究的重要组成部分，对于阐明中药复方的药效物质基础和作用机制，具有十分重要的意义。鉴于中药复方成分的复杂性和多样性，近年来，液相色谱-质谱联用(Liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS)技术越来越多应用于中药复方的分析。LC-MS技术是20世纪90年代发展起来的一门综合性分析技术，它集液相色谱的高分离能力与质谱的强鉴定能力于一体，对研究对象不仅有足够的灵敏度、选择性，同时还能够给出丰富的结构信息，分析快速而且方便，目前已成为中药复方研究领域强有力的分析工具，广泛应用于中药复方的质量控制、药代动力学和代谢组学等众多领域，极大地推动了中药的现代化进程。本文对近5年来国内外LC-MS技术在中药复方分析中的应用进行归纳总结，旨在为药学工作者更好的利用LC-MS技术进行中药复方的研究提供参考。

1 中药复方的质量控制研究

中药复方中包含多种中药材，这些中药材又含有大量不同类别、不同极性的化合物，因此，相对于单一中药材的质量控制而言，中药复方的质量控制更加复杂多样。目前，LC-MS技术已广泛应用于中药复方的化学成分鉴定、有效成分含量测定及指纹图谱研究等领域，发挥越来越重要的作用。近年来，随着超高效液相色谱(UPLC)技术的出现，使得色谱分析实现了高速度、高灵敏度和高分辨率。其与高分辨质谱如TOFMS的联用，为中药复杂体系研究提供了革命性的工具。汪航等［2］采用LC-MS/MS法鉴定了中药复方栀子大黄汤中30种活性成分，其中包括17种黄酮类成分、5种蒽醌类成分、2种香豆素类成分和6种环烯醚萜苷类成分，并选择代表性药物推断其质谱断裂特征，该方法适用于复方中不易获得对照品的未知化学成分的分析。王傲雪等［3］采用UFLC-MS法鉴定了茯苓汤中14种活性成分，并应用UFLC-DAD法测定了其中4种活性成分的含量，该研究用于茯苓汤的质量控制研究。耿放等［4］建立了UPLC-MS法用于中药复方逍遥散的指纹图谱研究，共标定了16个共有色谱峰，通过与对照品的保留时间及质谱信息的比对，指认了其中3个色谱峰，获得的指纹图谱特征性及专属性强，可用于逍遥散质量的控制。目前，LC-MS技术已成为中药复方分析必不可少的工具，具有较好的应用前景。

2 中药复方的药代动力学研究

中药复方药代动力学是药代动力学的延伸和发展，通过对复方药动学的研究有助于揭示复方药效的物质基础、方剂组方原理、指导临床合理用药、促进中药的剂型改革和新药研发，对中医药的现代化及国际化具有重要意义［5］。目前，血药浓度法是研究中药复方药动学的最常用的方法，该方法准确、适用性广，对于有效成分明确的中药或中药复方，能够得出准确的药动学参数，并且对于临床用药具有较好的指导意义［6］。中药复方中化学成分复杂且含量差异较大，进入体内后，原型药及代谢物在血浆、尿液和胆汁等体液中的含量往往只有ng级水平，一般的检测方法如薄层扫描法、高效液相色谱法等难以检测，而LCMS法只需对样品进行简单处理或衍生化就能快速测定，检测灵敏度和专属性均较高，适合于中药复方的药代动力学研究，大大推动了中药复方药动学的发展。何博赛等［7］建立LC-MS/MS法测定大鼠血浆中棘苷、芒果苷和阿魏酸的浓度，并将该方法应用于正常大鼠和失眠大鼠灌胃给予酸枣仁汤后的对比药动学研究，棘苷、芒果苷和阿魏酸的定量下限分别为1、6和1 ng/mL，方法的提取回收率均大于85%，结果表明，阿魏酸在正常组大鼠和失眠组大鼠间的药动学参数无显著性差异，而棘苷和芒果苷在失眠组大鼠体内的吸收明显低于正常组。王莹等［8］建立了UPLCMS/MS法用于测定大鼠灌胃给予葛根芪连汤后血浆中葛根素、大豆苷元、黄芩苷、次黄芩苷和甘草苷的浓度，葛根素、大豆苷元、黄芩苷、次黄芩苷和甘草苷的提取回收率分别为 79.8%、90.8%、74.4%、70.2%和84.7%，准确度和精密度均符合要求，该方法成功应用于大鼠灌胃给予葛根芪连汤后血浆中5种活性成分的药动学研究。黄萍等［9］建立UPLC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中大黄酸、大黄素、小檗碱和黄芩苷的浓度，检测方式为正离子和负离子切换的模式。其中，黄芩苷和小檗碱采用正离子方式检测，大黄酸和大黄素采用负离子方式检测，该方法具有较高的灵敏度和较短的分析时间(7 min)，4种物质的线性、准确度、精密度和提取回收率均满足要求，该方法成功应用于大鼠灌胃给予大黄黄连泻心汤后的血浆药代动力学研究。目前，LC-MS技术已经应用于中药复方的代谢研究，闻晓东等［10］采用液相色谱-飞行时间质谱仪鉴定大鼠灌胃给予补阳还五汤后尿液中的主要代谢产物，大鼠尿液样品采用固相萃取法进行预处理，检测时间为20 min，大鼠尿液中共检测到50种化合物，其中包括18种原形药物和32种代谢物。结果表明，葡萄糖醛酸化和硫酸化是异黄酮类化合物的主要代谢途径，谷胱甘肽结合、葡萄糖醛酸化和硫酸化是四氯苯酞的主要代谢途径，没有检测到与皂苷相关的代谢物。该研究为补阳还五汤的代谢提供了重要的结构信息，证明了LC-MS技术可以用于中药复方中代谢物的快速鉴定分析。

3 中药复方的代谢组学研究

代谢组学是通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)，其代谢产物的变化或随时间的变化，来研究生物体系的一门科学［11］。代谢组学的研究对象主要是相对分子质量小于1000的小分子物质。完整的代谢组学流程包括样品的采集与制备、代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标志物识别和途径分析等步骤。生物样品可以是血液、尿液、组织、细胞和培养液等，采集后首先进行生物反应灭活、预处理，然后运用核磁共振、质谱或色谱等手段检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢轮廓或代谢指纹，然后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，识别出有显著变化的代谢标志物，并研究所涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制，达到分型和发现生物标志物的目的［12］。代谢组学力求分析生物体系中的所有代谢产物，整个分析应尽可能保留和反映总的代谢产物的信息。目前，LC-MS技术在中药复方代谢组学的分析研究中发挥重要的作用。姜鹏等［13］采用LC-Q-TOF-MS技术研究了心肌梗死前期大鼠血清中的主要生物标记物以及麝香保心丸对心肌梗死的保护作用，在心肌梗死大鼠的血清中共指认出14种生物标记物，通过分析这些生物标记物，炎症、肥大和氧化性损伤被认为是早期心肌梗死关系最密切的组织病理学改变，通过鉴定这些主要的生物标记物不仅可以为早期心肌梗死的进展提供系统性的信息，而且还可以为早期心肌梗死的预防和治疗提供理论基础。结果表明，麝香保心丸可以通过调节类固醇激素的生物合成途径来起到对心肌梗死的保护作用。杨波等［14］采用UPLC-Q-TOF法研究了失眠症的代谢组学以及酸枣仁汤对于失眠症的干预作用，该研究可用于失眠症的吸收和代谢特征研究，包括主成分分析、偏最小二乘-判别分析、正交偏最小二乘-判别分析模式等模式识别方法用于研究代谢物的结构并发现新的代谢物，共发现20个差异性代谢产物，这些代谢物的变化与氨基酸和脂肪酸的代谢密切相关。结果表明，酸枣仁汤可能通过调节血清素能的激活发挥治疗作用，UPLC-Q-TOF法适合用于传统中药的代谢轮廓分析。

4 结语

中药复方是祖国医学几千年临床经验的结晶，是我国医学的瑰宝，但是中药复方活性成分复杂、代谢物在生物样品中浓度较低，且生物样品内源性杂质较多，给其研究带来了相当大的困难。随着商品化超高效液相色谱技术和高分辨质谱技术的不断发展成熟，以及专家系统、谱图库的不断完善，LC-MS技术在中药复方质量控制、体内药代动力学、药物代谢和代谢组学研究中的作用将更加广泛，也必将大大推动中药复方研究的现代化进程。

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