卵巢功能早衰中端粒及端粒酶作用的研究进展

王伟聿，唐 莉，2*

(1.昆明理工大学医学院，云南昆明650500;2.云南省第一人民医院生殖医学中心，云南昆明650032)

卵巢在女性的一生中扮演了重要的角色，不仅为卵泡提供发育的场所，还有分泌性激素的重要功能。随着年龄增长，卵巢的功能开始缓慢衰退，生殖器官也开始衰老萎缩，而其他器官也随之出现相应变化。停经作为卵巢衰老的重要标志，由卵泡耗竭造成。正常人的停经受环境和遗传等多因素共同影响。以最后一次月经发生的年龄为标准，停经平均发生于50.7岁。卵泡内卵细胞的分裂成熟、颗粒细胞的增殖分化凋亡在体内卵泡维持中起到了相当重要的作用，因此卵巢细胞的增殖能力对于卵巢产生和释放生殖细胞、分泌激素的功能至关重要。而端粒和端粒酶参与细胞增殖的调控，作者推测端粒和端粒酶参与了卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)致病机制。

1 卵巢功能早衰

POF是指妇女在40岁之前出现持续性闭经，伴随有促性腺激素(gonadotro-phin，Gn)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)水平升高，雌激素(oestrogen)水平降低等诸多临床表现［1］。除了闭经外，患者还会出现雌激素缺乏所致的泌尿生殖道症状和不孕等症状。POF的诊断标准为妇女40岁之前在至少4个月内出现了3次闭经，并且性激素降低，血清FSH水平在两个月内两次超过40 IU/L［2］。POF发生率逐年升高，并且开始低龄化，40岁以下的妇女中患病率接近1%，20～30岁的妇女中为0.1%，20岁以下妇女中为0.01%。

2 卵巢功能早衰的病因

POF的致病原因有很多，包括了染色体缺陷、基因遗传、自体免疫等，但仍有50% ～60%的患者仍找不到确切病因［3-4］。

POF有一定遗传性。约有12%～50%的POF患者有家族病史。通常认为POF和早停经都属于常染色体或X连锁显性遗传病［5］。目前POF尚无公认标记基因，但X染色体对于卵巢功能至关重要，Xp终端缺失可表现为原发性闭经或早停经，Xq终端缺失则引起POF。女性X染色体缺失导致特纳综合征(turner syndrome，Ts)。而其他定位于X染色体上的基因也能影响卵巢功能。成骨蛋白15(bone mophogenetic protein 15，BMP-15)的突变会影响早期卵泡生成。而FMR1(fragile X mental retardation 1)突变所致的脆性X综合征患者中POF发生率比常人高3倍。除外，一些常染色体基因突变也会导致POF的发生。如半乳糖-1磷酸酶尿苷转移酶基因(GALT)、FOXL2和EIF2B的突变都与POF 有关［6-7］。

约有30%的POF和自身免疫机制有关。少数胸腺缺陷的女性出现卵巢萎缩和卵泡缺失的症状。临床诊断发现5%～30%的POF患者同时患有免疫性疾病，如桥本甲状腺炎和阿狄森氏综合征。因此POF也有可能是这类免疫疾病的并发症。

外界因素也有可能导致POF。盆腔手术可能引起局部炎性反应而损伤卵巢，环磷酰胺会抑制颗粒细胞增殖和卵母细胞减数分裂，杀虫剂及重金属会破坏卵泡而导致POF。

3 端粒和端粒酶的功能

端粒最早在四膜虫细胞中发现，作用在于弥补DNA不完全半保留复制中引物降解所致的DNA单链序列损耗，保持染色体的完整性，限制细胞的分裂次数。人体不同组织细胞内端粒长度不同，主要受端粒酶、端粒结合蛋白、核糖基转移酶-核糖多聚酶等共同调控。一个细胞内端粒总长度约5～15 kb，精子和早期胚胎细胞端粒长度可达15～20 kb。随着细胞分裂染色体末端会丢失部分序列，每次分裂后染色体末端约失去50～200 bp，而在细胞一生中端粒共缩短大约2～15 kb［8］。端粒过短是细胞衰老的特征之一。过短端粒能够通过直接或者间接的方式激活P53，细胞进入衰老和凋亡过程［9］。

端粒在细胞衰老中发挥了重要作用，而其调控与端粒酶密切相关。端粒的完整复制依赖于端粒酶活性［10］。端粒主要有延长端粒，维持染色体稳定以及修复受损染色体末端等功能。

端粒酶具有反转录酶活性，能够以自身的RNA为模板合成端粒DNA。人类的端粒酶包括3个部分:1)端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR);2)端粒酶相关蛋白1(telomerase associated-protein 1，TP1/TLP1);3)端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit，hTERT/hTRT)。正常体细胞中往往存在hTR，却没有端粒酶活性。但模板区对于端粒酶结合DNA及其反转录酶活性是必需的。此外，hTR的模板序列突变也会影响端粒的稳定性［11］。hTERT基因是单拷贝基因，在胚胎和肿瘤中都有较强的表达，其表达量与端粒酶活性正相关。

总之，端粒和端粒酶通过多个途径参与了人体的发育、生殖、衰老和疾病发生等多个环节多水平复杂调控，其中涉及了多个基因在转录前，翻译，翻译后多个水平的调控，包括端粒结合蛋白、细胞周期蛋白及相关细胞因子、相关蛋白的磷酸化和去磷酸化等多个方面。

4 端粒/端粒酶与卵巢功能早衰的关系

女性的生殖寿命由出生时卵巢内的卵泡决定。正常卵巢衰老取决于原始卵泡消耗速率。而卵泡数是卵泡补充、维持和消耗相平衡的结果［12］。卵巢内细胞增殖在卵泡补充和维持过程中起到了主要作用，同颗粒细胞增殖分化和随后的衰老凋亡共同促进了卵细胞分裂成熟和性激素的产生。一些POF患者卵巢细胞内的端粒短于正常人［13］。而在卵巢中，颗粒细胞的增殖发育以及卵母细胞的成熟都同端粒密切相关。

卵泡发育时，颗粒细胞大量增殖分化，而端粒的长度影响颗粒细胞的增殖能力。端粒过短导致颗粒细胞的增殖速度减慢，分泌的雌激素不能满足需要，造成卵泡的发育滞后，因此才会出现停经、雌激素水平降低等症状。在患有隐匿型卵巢功能不全患者体内，颗粒细胞内的端粒酶活性以及端粒长度都出现了异常［14］，证实POF与颗粒细胞内端粒酶失活有关。卵丘细胞由颗粒细胞分化而来，研究发现其端粒长度和胚胎质量有关，卵丘细胞端粒较长则卵细胞质量更好［15］。

端粒的长度还会影响卵母细胞的质量。女性生殖衰老的端粒理论指出在女性衰老过程中卵细胞出现了包括减数分裂染色体不分离、胚胎停滞、凋亡和流产在内的功能紊乱［16］。而这都源自两次“打击”:卵原细胞生成时染色体交叉减少和排卵间隔期间的活性氧损伤。而细胞分裂时染色体交叉减少同细胞内的端粒过短有直接关系。端粒DNA缺失的卵母细胞更易发生染色体非整倍性。端粒缩短时细胞第1次减数分裂(meiosis I，MI)染色体之间的交叉和联会也减少。而这样的缺陷有可能导致细胞分裂时染色体不分裂和细胞内的染色体非整倍性［17］。而活性氧损伤损耗了卵母细胞内的端粒。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够保护卵细胞内的端粒，提高卵母细胞质量［18］。

5 影响卵巢细胞端粒长度的可能机制

端粒长度主要受到端粒酶的调控。在体外培养的卵巢表皮上皮细胞(ovarian surface epithelium，OSE)中过度表达TERT基因能够维持细胞内的端粒长度，并增加细胞的分裂潜能。在前窦状卵泡中，颗粒细胞端粒酶活性较高，分裂最为旺盛;随后端粒酶活性逐渐降低，颗粒细胞分裂逐渐减缓［19］，表明卵泡正常发育需要维持端粒酶活性。

雌激素参与调控卵巢内端粒酶的活性。雌激素与胞内的雌激素受体(estrogen receptor，ESR)形成复合体，结合靶基因启动子上的雌激素反应元件(estrogen receptor elements，ERE)，调控靶基因的表达。雌激素受体包括ESR1(ERα)和ESR2(ERβ)两类，二者存在于颗粒细胞中且都参与hTERT基因调控，以ESR2为主。同时ESR1在排卵、黄体生成和间质腺体发育中也发挥着特殊的作用。

雌激素主要通过两种方式调控TERT基因表达:1)雌激素受体ESR1直接作用于TERT基因启动子的ERE上，并上调端粒酶的表达［20］;2)雌激素刺激转录因子MYC的表达［21］，再进一步通过Aurora-a激酶、肿瘤抑制因子BACR1、tgf-β、信号传导因子SMAD3和促分裂素原活化蛋白激酶MAPK来调节TERT基因的表达。中国POF患者体内发现的TGF-β 受体 TGFBR3 错义突变［22］，影响了 TGF-β 通路中的转录因子Smad家族对卵泡发育和颗粒细胞增殖调控［23］，其中 Smad3能够通过 MYC作用于hTERT启动子的E-box元件结合，调节细胞内的hTERT 表达［24］。

其次，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)通过MAPK作用于TERT基因启动子，调控端粒酶的活性。POF患者卵巢内的EGF水平显著低于正常人，说明EGF表达与POF有关。EGF能够激发猪大小卵泡颗粒细胞中的端粒酶活性，却对上皮细胞和子宫内膜细胞没有作用。据此，某些未知因素通过EGF调控POF患者体内颗粒细胞的端粒酶活性，并借此调节卵巢的功能。

不仅如此，端粒酶的泛素化降解也参与了这一过程。FMR1突变的小鼠卵泡内的包括TERT在内的蛋白高水平泛素化降解［25］，限制了相关细胞的增殖能力，进而引起了卵泡提前耗竭。而在许多POF患者卵巢内端粒酶活性和表达都较同龄人低，提示TERT高度泛素化可能与FMR1突变所致POF患者体内卵泡耗竭有关。

端粒酶活性缺失的卵细胞出现受精异常和胚胎异常分裂。端粒酶缺陷型小鼠也出现了不育。尽管在胚胎的早期分裂阶段，同源重组能够显著延长端粒，但不足以弥补细胞中端粒的损失。

除此之外，体内的氧化应激反应也能影响端粒长度。端粒中富含鸟嘌呤，其中的氨基和亚氨基易被氧化。药物增加细胞内的活性氧基团(reactive oxygen spieces，ROS)后，胚胎发育被扰乱。而NAC能够清除ROS，保护端粒，防止细胞凋亡。

综上所述，POF病因复杂，目前还没能找到POF的致病原因。但因为端粒和端粒酶与卵泡发育和卵母细胞的分裂成熟密切相关，根据卵巢中端粒长度和端粒酶活性随年龄的老化、卵巢功能下降而逐渐降低以及卵巢早衰功能患者端粒酶活性低等临床发现，端粒及端粒酶可能为临床卵巢功能早衰的诊断和治疗提供新的途径，而端粒及端粒酶的相关研究也有望为诊断和治疗卵巢功能早衰提供理论和实验依据。

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