重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化＊

严子琴，刘丽，刘俊，施思，李海龙，蒋哲，孟凡国，周海梦，徐蓓，丁先锋，胡卫江，欧文斌△（.浙江清华长三角研究院／浙江省应用酶学重点实验室／生物分析技术实验室，浙江嘉兴 4006；.中国计量科学研究院，北京 000；.浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州 008）

人源甲胎蛋白（AFP）是一种肿瘤相关的单链糖蛋白，其糖链部分具有癌胚性变化的特征。AFP为胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，出生1周后表达消失，以后完全被清蛋白所替代［1－3］。健康人不表达AFP，当患肝细胞癌、卵黄囊和胚胎样肿瘤及部分肝外肿瘤时机体可重新合成AFP，因此临床上AFP被当成一种肝癌及生殖细胞肿瘤的经典血清标志物来使用，且对良恶性肿瘤的诊断、肿瘤治疗的疗效监测及肿瘤预后都具有重要临床意义［4－5］。本文从真核（毕赤酵母GS115）蛋白表达体系入手，研究人源AFP的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化及临床活性分析，为研制AFP标准物质及其可溯源校准品、质控品和体外诊断试剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种和培养基质粒pReceiver－AFP 由复能基因合成。质粒pPICZαA 购自Invitrogen。DH5α、BL21（DE3）和GS115均为本实验室保存。LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，pH 7.0，固体培养基加2%琼脂。BMGY 培养基：1mol／L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）10%，10×酵母无氨基氮源（YNB）10%，10×甘油10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。BMMY 培养基：1mol／L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）10%，10×YNB 10%，10×甲醇10%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，500×生物素0.02%。

1.2 肝癌血清标本选择3例临床肝癌患者血清标本，标为1、2、3号。1号标本为女患者的血清，年龄50岁，AFP 为281661.00ng／mL，治疗期给予的抗病毒药物为阿德福韦酯；2号标本为男患者的血清，年龄28岁，AFP 为80200.45ng／mL，治疗期间未给予抗病毒药物治疗；3号标本为女患者的血清，年龄44岁，AFP为2013.18ng／mL，治疗期给予的抗病毒药物为阿德福韦酯。3例患者的肝癌类型均为巨块型。

1.3 仪器与试剂限制性内切酶、T4DNA 连接酶购自大连宝生物公司；DNA 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根公司；增强化学发光法（ECL）免疫印迹试验（WB）检测试剂盒购自Millipore公司；抗His兔多抗与抗AFP 鼠单抗购自Santa Cruz Biotechnology；抗兔与抗鼠二抗均购自GE Healthcare。

1.4 构建重组人源AFP 酵母表达载体以质粒pReceiver－AFP为模板，上游引物CGC CGG AAT TCA TGA AGT GGG TGG AAT CAA T（含EcoRⅠ酶切识别位点），下游引物CTA GTC TAG AAA CTC CCA AAG CAG CAC GAG（含XbaⅠ酶切识别位点），聚合酶链反应（PCR）扩增带双酶切识别位点的afp目的基因片段，再将毕赤酵母表达载体pPICZαA 和afp PCR 扩增基因片段同时用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后经T4 DNA 连接酶连接，得到重组表达质粒pPICZαA－AFP。测序结果与GeneBank公布的AFP序列完全一致。

1.5 重组蛋白的诱导表达重组质粒pPICZαA－AFP经电转化法（Bio－Rad电转仪）转入毕赤酵母GS115。选取经PCR 鉴定为阳性单克隆的4株重组菌株即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6，接种于15mL BMGY 培养基中，30℃振荡培养至OD600达到2～6，2500r／min 离心5 min，弃上清液，用20mL BMMY 培养基重悬细胞，30℃振荡培养甲醇（0.5%）诱导蛋白表达。诱导开始后每隔24h取样，标本经8000r／min离心1min，将上清液和细胞沉淀分离并放置在4℃下。同时，补加无菌的100%甲醇至终浓度为0.5%以维持诱导。

1.6 SDS－聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）及WB 将经过处理后的蛋白进行10%SDS－PAGE，电泳完毕后1块胶考马斯亮蓝染色，蛋白条带通过全自动凝胶成像系统进行扫描分析。另1块胶电转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1h，抗AFP鼠单克隆一抗4℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）冲洗后加抗鼠二抗室温孵育1h，通过ECL 用Quant LAS 4000 mini进行曝光成像［7］。将AFP 高表达菌株即UNT－AFP－4接于2L 的摇瓶中进行诱导表达。每间隔24h取样并补加甲醇，持续诱导表达4d，将样本处理后进行Western blot检测分析及蛋白量测定。将第4天的发酵液离心后收集上清液，硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，HPLC 分析其纯度、Western blot和电化学发光法分别检测其免疫反应性和水平。

1.7 重组蛋白AFP的纯化及测定

1.7.1 重组蛋白AFP的纯化毕赤酵母GS115分泌表达的AFP不带His标签，用硫酸铵分级沉淀（30%、55%、75%）进行纯化。

1.7.2 AFP蛋白纯度水平测定纯化的AFP纯度用安捷伦1200HPLC仪测定。蛋白水平定值由嘉兴市第一医院罗氏E601电化学发光免疫分析仪分析测定，试剂为罗氏原装进口。

2 结果

2.1 重组人源AFP在毕赤酵母GS115中的高表达株筛选甲醇诱导目的蛋白AFP在GS115中表达，筛选UNT－AFP（即不带His和c－myc标签的AFP）的高表达株。挑取4株经PCR 鉴定为阳性克隆菌株，即UNT－AFP－1、UNT－AFP－4、UNT－AFP－5和UNT－AFP－6分别用15mL BMMY 培养基进行小量摇瓶诱导表达。Western blot检测AFP表达情况，并用电化学发光法检测AFP水平。在70×103附近有特异性蛋白条带，而pPICZαA／GS115阴性对照在此位置没有条带。进一步对重组表达的AFP 进行定量检测，AFP 在UNT－AFP－1中水平为316.7ng／mL；在UNT－AFP－4中为402.1ng／mL；在UNT－AFP－5中为334.6ng／mL；在UNT－AFP－6中为259.7 ng／mL。其中UNT－AFP－4的表达量相对最高，因此选此菌株进行后续的蛋白表达纯化。

2.2 重组人源UNT－AFP－4在毕赤酵母GS115中的大摇瓶表达及纯化结果AFP能在酵母GS115中稳定表达，发酵第4天AFP 的特异性条带最亮，检测其AFP 水平为102.9 ng／mL。

2.3 HPLC 分析经硫酸铵沉淀后的AFP HPLC 图谱上出现两个峰，出现时间分别是2.078、2.752 min，峰面积分别是34923.9和408.5，AFP 的峰面积占总峰面积的98.844%，即经55%硫酸铵沉淀后的AFP纯度为98.844%。Western blot检测到AFP特异性免疫反应条带。电化学发光法检测AFP含量分别是3473ng／mL（55%硫酸铵集份）和76.7ng／mL（75%硫酸铵集份）。据此计算，55%硫酸铵集份含有87%的AFP蛋白。

2.4 Western blot分析经硫酸铵沉淀后的AFP 将55%硫酸铵沉淀后收集的AFP与临床肝癌血清标本进行Western blot比对分析，结果发现制备的AFP与临床肝癌血清标本的分子大小相当，表明二者糖基化水平相近。

3 讨论

目前，肝癌检查主要包括血清AFP 和肝脏影像学检查［6－8］。检测AFP是当前诊断肝癌最简便、灵敏、快捷的方法，在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物，因而被当作诊断肝癌的金标准［9］。

最近研究表明，AFP有其复杂的生物学功能。文献［6］报道发现AFP与肿瘤细胞的恶性生长、转移和侵袭密切相关，并且认为AFP是肝癌细胞耐药的关键性细胞因子，研究结果显示AFP具有潜在的抗凋亡诱导作用的生物学性质。最新的一项研究中发现AFP具有抑制抑癌基因的生物学功能，导致肝癌细胞耐受全反式维A 酸诱导的凋亡。

在此研究中，作者前期也研究了AFP 在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达，与刘继洪［4］发现AFP 在大肠杆菌中能表达的结果相符。但在研究重组AFP 表达的过程中，重组人源AFP在BL21（DE3）中的表达主要存在于包涵体中，必须通过变、复性才能获得有免疫原性的目的蛋白，且经纯化得到的AFP水平只有360.2ng／mL，因此结果没有在本文中列出。此外，原核表达获得的AFP与人源AFP相比相对分子质量较小，分析其原因可能与其无糖基化和蛋白折叠的差异有关。相较于此，在GS115中表达的AFP均能分泌到胞外易于目的蛋白的收集，且经硫酸铵的初步纯化后纯度就可达90%以上，活力是BL21（DE3）中表达的AFP的10倍之多。此外，将GS115中表达纯化后获得的AFP与临床肝癌血清标本进行相对分子质量的比较，发现在GS115中异源表达的人源AFP相对分子质量与肝癌血清标本相近，其糖基化水平可能相近，但确切的结论还需要进一步的研究论证。

目前，AFP主要是从啮齿类动物胚胎和人胚胎血清中提取获得，通过此方法获得的AFP量少，而通过酵母表达和纯化可获得大量的且具有免疫原性的高纯度AFP。当前临床AFP检测上，仍然呈现外国诊断试剂盒独当一面的趋势，国内相应的体外诊断试剂盒和校准品、质控品还相对空白。本研究可为将来制备体外诊断试剂盒、可溯源的AFP校准品、质控品以及更多AFP新功能的进一步研究奠定基础。

［1］Wang S，Jiang W，Chen X，et al.Alpha－fetoprotein acts as a novel signal molecule and mediates transcription of Fn14 in human hepatocellular carcinoma［J］.J Hepatol，2012，57（2）：322－329.

［2］Mizejewskia GJ，Butterstein G.Survey of functional activ－ities of alpha－fetoprotein derived growth inhibitory peptides：review and prospects［J］.Curr Protein Pept Sci，2006，7（1）：73－100.

［3］Mizejewski GJ.Therapeutic use of human alpha－fetoprotein in clinical patients：is a cancer risk involved［J］.Int J Cancer，2011，128（1）：239－242.

［4］刘继洪.人甲胎蛋白基因原核克隆和表达［D］.杭州：浙江大学，2004.

［5］Johnson PJ.The role of serum alpha－fetoprotein estimation in the diagnosis and management of hepatocellular carcinoma［J］.Clin Liver Dis，2001，5（1）：145－159.

［6］Li M，Li H，Li C，et al.Alpha－fetoprotein：a new member of intracellular signal molecules in regulation of the PI3K／AKT signaling in human hepatoma cell lines［J］.Int J Cancer，2011，128（3）：524－532.

［7］陈石根，周润琦.酶学［M］.上海：复旦大学出版社，2001.

［8］Li M，Li H，Li C，et al.Alpha fetoprotein is a novel protein－binding partner for caspase－3and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells［J］.Int J Cancer，2009，124（12）：2845－2854.

［9］Li M，Zhou S，Liu X，et al.alpha－Fetoprotein shields hepatocellular carcinoma cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand［J］.Cancer Lett，2007，249（2）：227－234.