基于增加输入电阻的刺吸电位仪改进与试验研究

梁相志，李静静，卢少华，潘建斌，吴莉莉，邢玉清，闫凤鸣

(1.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州450002;2.河南农业大学理学院，河南 郑州450002)

刺吸电位技术(Electrical Penetration Graph，EPG)是用来记录刺吸式口器昆虫(如棉蚜、烟粉虱、棉盲蝽、稻褐飞虱等)口针在寄主组织中刺探、取食行为电信号变化特征的技术，可以准确记录刺吸式口器昆虫口针在寄主组织中的刺探行为和位置，使昆虫口针在植物内的活动转化为一种可视信号［1］，目前主要应用于刺吸式口器昆虫的取食行为、传播植物病毒和植物抗虫机制等方面的研究［2～4］.MCLEAN 等［5］最早研制的取食监测系统(Electronic Measurement System，EMS)，其输入电阻(Ri)为106Ω，只能初步证明蚜虫不同取食行为产生的输出波形不同.这一技术在实践中得到了多次改进［1，6～8］，TJALLINGII［1］采用直流回路系统，并使用高值输入电阻(Ri)109Ω，使仪器能输出更加准确、细致的波谱.目前有直流和交流2种EPG系统，基于交流电路设计的系统称为交流刺吸电位仪(Alternating Current EPG，AC-EPG)，其 R成分和emf成分的变换都可引起输出电压的变化;基于直流电路设计的系统称为直流刺吸电位仪(Direct Current EPG，DC-EPG)，其R成分固定，输出电压的变化仅为emf成分，中国目前应用的基本都是DC-EPG.EPG技术可作为研究刺吸式昆虫取食行为的最为有效的工具，是因为EPG的波谱与昆虫的刺探行为、唾液分泌、取食等生理过程相对应，可以通过对EPG波谱的分析认识昆虫的取食过程.MCLEAN等［9］分析了豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)取食行为与电子记录波形的对应关系.该技术在植食性刺吸式昆虫(如蚜虫、粉虱、叶蝉和蓟马等)与植物关系研究中的应用日益深入，尤其是对蚜虫和粉虱的研究.介体昆虫中主要以半翅目昆虫为主，这些昆虫(如棉蚜、烟粉虱、棉盲蝽、稻褐飞虱等)多数为农林作物害虫，依靠其取食口器在植物上频繁地进行刺探取食活动，成为传播植物病毒效率最高的介体，这是因为半翅目昆虫口针刺探寄主植物对植物细胞造成的损害较小，因此更适于传播病毒［10］.最近的研究表明介体传播病毒与其取食行为有关，EPG技术已经成为研究介体传毒机理地有效工具［2，4，11，12］.目前，多数的 EPG 研究已不再局限于分析不同种昆虫的刺探、取食行为波形差异，而是建立在波形基础上的刺吸式口器昆虫对寄主植物的选择性、昆虫传播植物病毒的机制和植物的抗虫机制以及内吸性农药的测定等行为生态学领域，并已成为昆虫生理学研究的热点之一.为了深入研究介体取食行为与传毒之间的关系、植物的抗虫机制及内吸性农药的测定，需要更为精细的波形，因此，本研究基于提高EPG仪器的输入电阻(Ri)对刺吸电位仪进行改进，以获得更为精确的波形.

1 材料与方法

1.1 供试昆虫和植物

烟蚜Myzus persicae为实验室在烟草Nicotiana tabacum(中烟100)植株上饲养的多代种群，饲养条件为温度(28±2)℃，光周期16 L∶8 D，相对湿度(75±2)%.烟草(中烟100)在温室内同样条件下培养.无翅成蚜和4～5叶期烟苗用于EPG记录.

1.2 EPG仪器改进方案

现有荷兰产直流刺吸电位仪Giga-4型输入电阻为109Ω，对原有运算放大器已达设计极限，为此，通过对运算放大器和信号放大通道进行设计，使得输入电阻可以提高到1010Ω，明显提高波形的相对振幅和频率［8］，将输入电阻提高到1010Ω，这在国内外文献中未见报道.

增加输入电阻(Ri)是获得精细波形的有效途径.现有EPG仪中输入阻抗最高可达109Ω，改进的仪器输入电阻采用1010Ω.研究表明，输入阻抗越高，仪器输出的生物电信号响应会越明显［8］.用增加输入电阻(1010Ω)的直流刺吸电位仪Giga-4型(DC-EPG)进行蚜虫在烟草植株上的取食行为记录试验，数字转换器(A/D)为 DI-720型(DATAQ instruments).以现有 EPG(输入电阻为109Ω)记录蚜虫在烟草植株上的取食行为作为对照.

1.3 波形记录

试验所用金丝(直径12.5 μm)购自荷兰瓦赫宁根大学，导电银胶为本实验室(河南农业大学)配制(专利授权号ZL201010610889).按照汤清波等［13］的方法将2～3 cm的金丝用导电银胶粘连到蚜虫的前胸背板上.在粘连金丝之后，对蚜虫进行30 min饥饿处理，随后将蚜虫放在烟草上，连续记录蚜虫取食行为6 h.波形由A/D转换器收集并转换，在计算机上由 WinDaq软件(DATAQ instruments)显示波形.

对所记录波形进行分析，记录波形的振幅、频率、电压水平.蚜虫的pd波、E1波和E2波特征比较明显，pd波表明蚜虫口针在植物细胞内刺探，E1波表明蚜虫在植物韧皮部内分泌唾液和主动取食，E2波表明蚜虫在植物韧皮部内被动取食，因此对EPG输入电阻为109Ω和1010Ω时记录的蚜虫pd波、E1波和E2波特征(相对振幅、频率和电压水平等)进行比较.相对振幅是以整个波形最高电压振幅为100的前提下进行比较，频率为每秒波动的次数，电压水平由WinDaq软件显示记录.

2 结果与分析

2.1 整体记录波形对比

增加输入电阻为1010Ω，记录蚜虫在烟草上的取食波形与原EPG仪器记录波形进行比较，从图1(A，B)可以看到，输入电阻为1010Ω时所记录的波形与原仪器记录的波形相似，整体上变化不大.未刺探波与基线几乎重叠，波动频率非常小.A图和B图中波形的刺探波频率类似，为正压;A图和B图中蚜虫在烟草植株上的韧皮部取食波形变化相似，均为负压.

2.2 pd 波比较

增加输入电阻后记录的pd波相对振幅和频率均有所提高.增加输入电阻后记录的pd波相对振幅为65.55，较现在刺吸电位仪记录的pd波的相对振幅(63.42)高，频率也有所增加(表1).蚜虫的pd波又可分为pd-I，pd-II和pd-III 3部分，其中pd-II亚波为负压波形部分，又可细分为II-1，II-2和II-3部分.图1中C图pd亚波和D图pd亚波相比，相对振幅和频率有所提高，II-1和II-3部分尤为明显(表1).

图1 不同输入电阻下DC-EPG记录波形比较Fig.1 Comparison of DC-EGP waveforms under different input resistors

表1 DC-EPG波形特征比较Table 1 Characters of DC-EPG waveforms

2.3 E1 波比较

增加输入电阻后，EPG记录的蚜虫在韧皮部取食的波形比较均一，相对振幅和频率有所提高.从图1(E，F)可以观察到，增加输入电阻1个数量级后，E1波的波动比较均一，相对振幅为13.42，频率为3.88 Hz;F图为原刺吸电位仪记录的E1波形，波动落差较大，相对振幅为12.72，频率为2.75 Hz.增加输入电阻后记录的E1波较原仪器记录的E1波在频率上差异显著(P＜0.05).

2.4 E2 波比较

E2波为昆虫在韧皮部内被动取食的波形，增大输入电阻后所记录的波形较为均一，相对振幅和频率有所提高.从图1(G，H)可以观察到，增加输入电阻后记录的E2波变化较为均一，相对振幅和频率均较原有仪器记录的波形有所提高(表1).增加输入电阻后记录的E2波较原仪器记录的E2波在相对振幅和频率上差异显著(P＜0.05).

3 讨论

增加EPG仪器的输入电阻(Ri)为1010Ω，波形的相对振幅和频率均有所提高，表明增加输入电阻能够有效提高波形的精确度.昆虫介体传播植物病毒与其取食过程中口针刺破细胞膜的行为有关［11，14，15］，利用 EPG 分析昆虫的取食行为可以评价昆虫的获毒、传毒细节.由于蚜虫传毒时必须将病毒分泌到植物的活细胞内病毒才能存活，同时获毒亦需要从细胞或韧皮部吸食时进行，因此穿刺细胞的pd波和韧皮部波形(分泌唾液的E1波和吸食汁液的E2波)对传毒尤为重要，通过增加输入电阻获得精确度更高的波形，将有助于介体传毒方面的研究.POWELL［16］使用EPG技术研究了桃蚜M.persicae传播马铃薯Y病毒的取食行为，发现pd波的出现对桃蚜的成功传毒有关.pd波是昆虫在植物表皮层细胞的试探性取食时刺破细胞膜而产生的，蚜虫的pd波又可分为pd-Ⅰ，pd-Ⅱ和pd-Ⅲ3部分，其中pd-Ⅱ亚波又可细分为Ⅱ-1，Ⅱ-2和Ⅱ-3部分，pd-Ⅱ亚波与介体获毒、接种病毒有关，蚜虫的获毒过程发生在pd亚波的Ⅱ-3阶段(取食)，接种病毒过程发生在Ⅱ-1和Ⅱ-2阶段(分泌唾液)［14，17，18］.图 1(C，D)比较了不同输入电阻(Ri)所记录的pd波，尤其是pd-Ⅱ亚波，结果表明发现增加输入电阻1个数量级后，记录的波形相对振幅和频率有所提高，输出波形更为精确，可以更好地应用于分析介体昆虫的取食行为与传播植物病毒间的关系.

研究表明介体昆虫传播植物病毒与其取食行为有关，通过增加输入电阻改进EPG，可以更好地应用于介体传毒行为方面的研究.JIANG等［2］利用刺吸电位技术研究烟粉虱的取食行为与传播番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)之间的关系，通过比较213头带毒烟粉虱在单株植物上的取食行为，发现烟粉虱的传播效率与E1波出现的次数和E1波持续的时间有关，带毒烟粉虱的刺探次数和E1波持续时间明显增多.STAFFORD［12］利用EPG技术研究西花蓟马(Western flower thrips)传播番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)，发现TSWV能增加西花蓟马的刺探次数来促进病毒传播.LIU等［4］利用EPG技术研究烟粉虱的取食行为与传播TYLCV之间的关系，通过比较B型和Q型烟粉虱分别在介体带毒水平和植物带毒水平上取食行为，发现Q型烟粉虱在带毒植物上有更多的取食行为.利用改进后的EPG波形进行介体传播植物病毒与取食行为关系的研究，通过分析更为精确的波形，可能会提供更有力的证据.

EPG技术已经应用于研究内吸性杀虫剂吡虫啉(Imidacloprid)对刺吸式口器昆虫(蓟马、蚜虫、烟粉虱)取食行为的影响［19～22］，CUI 等［23］利用EPG研究了环氧虫啶(Cycloxaprid)对吡虫啉抗性蚜虫(Imidacloprid-resistant aphids)的取食影响.通过增加输入电阻1个数量级后，输出的波形具有更高的精确度，在以后的研究中可将改进后的EPG仪器应用于内吸性杀虫剂对昆虫取食行为影响的研究.

目前使用的刺吸电位仪存在一些不足，如对环境干扰敏感、信号获取和分析软件不稳定和使用材料限制昆虫活动等，虽然增加输入电阻可以改善波形的精确度，但很难满足现代科研的需要.因此，我们还将进一步对刺吸电位仪进行创新，采用新型硬件设计全面提高仪器的抗干扰性能，采用新型运算放大器和新型A/D采集卡，同时应用FFT、随机共振和小波变换等数字信号处理方法，全面提高信噪比，使仪器输出波形的分辨率和精确度比现有仪器提高10倍以上，这将有助于介体昆虫取食行为与传毒机理的研究.

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