猪源附红细胞体rnpB基因的克隆与序列比较

2014-04-13王向佩米荣升沈莉萍王晓娟杨晓娇刘宇轩雷晓思陈兆国

中国动物传染病学报 2014年3期

王向佩，周鹏，米荣升，沈莉萍，黄燕，王晓娟，杨晓娇，石凯，刘宇轩，雷晓思，陈兆国，赵权

（1. 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2. 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室中国农业科学院动物源性食品安全研究中心，上海 200241；3. 上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

王向佩1,2，周鹏2，米荣升2，沈莉萍3，黄燕2，王晓娟1,2，杨晓娇2，石凯2，刘宇轩2，雷晓思2，陈兆国2，赵权1

为了解猪源附红细胞体（Mycoplasmaspp.）RNA酶P RNA（RNase P RNA，rnpB）基因序列变异状况，将实验室保存的经16S rRNA基因序列分析鉴定的53份猪源附红细胞体阳性DNA样品用于rnpB基因的扩增，扩增产物克隆至pMD18-T载体并进行序列测定。将获得的序列与GenBank登录的猪附红细胞体（Mycoplasma suis）德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）进行分析和比对，利用MEGA5.0软件构建系统发育树，并与16S rRNA判定结果进行比较。结果共得到42条猪附红细胞体rnpB基因和11条小附红细胞体（M. parvum）rnpB基因序列。猪附红细胞体上海分离株rnpB基因与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因之间的核苷酸序列相似性为98.1%～100.0%；小附红细胞体上海分离株rnpB基因与猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列的相似性为91.0%，与猪附红细胞体上海分离株rnpB基因序列相似性为90.0%～91.0%。系统进化分析显示猪附红细胞体rnpB基因与小附红细胞体rnpB基因分布在不同聚簇上，与16S rRNA基因序列鉴定结果一致。

猪附红细胞体；小附红细胞体；rnpB；克隆；序列比较

猪的附红细胞体病（eperythrozoonosis）是由附红细胞体（Mycoplasma spp.）寄生于猪的红细胞表面、血浆及骨髓等引起的[1,2]，以发热、贫血、黄疸为主要临床症状的人兽共患传染病[3]。该病不仅导致畜产品质量和产量降低，而且可以降低猪的生育力，临床上又常与弓形虫病（toxoplasmosis）、大肠杆菌病（colibacillosis）、链球菌病（streptococcal disease）、温和性猪瘟（swine fever）等其他疾病并发感染，不仅给诊断造成困难，而且导致动物发生严重的临床症状甚至死亡，阻碍养猪业的发展，造成严重的经济损失[4]。附红细胞体宿主广泛，猪、牛、羊、犬、兔、鸡和人等都是附红细胞体的易感动物，其中猪的发病率较高，猪附红细胞体病是急待控制的重要疫病之一[5]。

据文献报道，寄生在猪体内的附红细胞体共有两种，分别为猪附红细胞体（Mycoplasma suis）和小附红细胞体（M. parvum）[6-8]。16S rRNA基因由于其极其缓慢的演化速度，在细菌分类上被广泛地作为基因间的系统发育标记，应用于物种鉴定。然而附红细胞体16S rRNA基因扩增的特异性较差[9-11]，常引起非特异性扩增，导致假阳性结果的出现。RNA酶P RNA（RNase P RNA，rnpB）基因在微生物中是编码单一RNA的内切核糖核酸酶P，其全长基因将近400 bp。相比16S rRNA序列，rnpB基因具有较高的核苷酸变异率，更适合用于分类单元相近微生物之间的系统发育分析。本研究对经16S rRNA鉴定的猪附红细胞体和小附红细胞体阳性样品进行rnpB基因部分序列的扩增，分析其在种内及种间的差异，探索其在猪源附红细胞体鉴别诊断中的价值，进一步了解猪源附红细胞体rnpB基因变异状况，为鉴别猪源附红细胞体种类，准确诊断附红细胞体病打下基础。

1 材料与方法

1.1 猪源附红细胞体阳性样品DNA猪附红细胞体阳性DNA样品42份、小附红细胞体阳性DNA样品11份由中国农业科学院上海兽医研究所隐孢子虫病防治课题组保存提供，这些样品分离自上海市长宁区、松江区、嘉定区某屠宰场，经16S rRNA基因序列分析鉴定种类。

1.2 酶及试剂LA Taq酶、pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；O’GeneRulerTMUltra Low Range DNA Ldder购自 Ferment公司；2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA胶回收试剂盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit购自Axygen公司；大肠杆菌感受态细胞Trans1-t1购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物合成根据文献[12]中报道的引物序列设计形成，上游引物：5'-TATTTAAAGTAGAGGAAAGTC -3'，位于rnpB基因（登录号：EF523602）10～30处；下游引物：5'-GAGGAGTTTACCGCGTTT -3'，位于206～223处。引物由上海英俊生物技术有限公司合成，预计扩增片段长度为214 bp。

1.4 附红细胞体rnpB基因的扩增取出－20℃冰箱保存的阳性样品DNA，进行猪附红细胞体以及小附红细胞体rnpB基因的PCR扩增。PCR反应体系为50 μL，包括5 U/μL LATaq酶0.5 μL，10×LA Taq PCR buffer Ⅱ 5.0 μL，100 μmol/L上、下游引物各0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP 8 μL，模板DNA 1.0 μL，灭菌ddH2O 35.3 μL。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火120 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸7 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后由凝胶成像系统Image Quant300（美国GE公司）拍照。

1.5 rnpB基因序列测定与分析将PCR产物胶回收后与pMD18-T载体连接，进行基因克隆，经菌液PCR鉴定正确后，阳性菌液送上海华大生物技术有限公司测序。将测序结果通过NCBI进行在线BLAST同源性搜索，用DNAMAN软件（版本7.0.2.176）进行基因的核苷酸序列相似性分析，用DNASTAR中的Megalign软件（版本7.0.1.44）进行序列同源性比较，利用BioEdit软件（版本号7.0.9.0）对序列进行Clustal W分析。

1.6 不同种间rnpB基因的进化树分析从GenBank下载猪附红细胞体（登录号：EF523602、EU078611）、小附红细胞体（登录号：AB614639、AB614640、AB614641）、温氏附红细胞体（M. wenyonii，登录号：EU078610）、绵羊附红细胞体（M. ovis，登录号：EF078612）、球状附红细胞体（M. coccoides，登录号：EU078619）、发酵支原体（M. fermentans，登录号：U41756）、猫附红细胞体（M. haemofelis，登录号：EU078617）、犬附红细胞体（M. haemocanis，登录号：EU078618）、嗜血小附红细胞体（M. haematoparvum，登录号：EU078616），以及CandidatusMycoplasma haemolamae（登录号：EU078613）、CandidatusMycoplasma haemominutum（登录号：EU078614）、CandidatusMycoplasma kahanei（登录号：EU078615）、CandidatusMycoplasma aoti（登录号：HM123756）、CandidatusMycoplasma haemocervae（登录号：AB561882）、CandidatusMycoplasma turicensis（登录号：EF212002），用Mega 5.0软件以邻接法（Neighbor-Joining method，NJ）绘制系统进化树。

2 结果

2.1 PCR扩增结果对猪附红细胞体和小附红细胞体共53份阳性DNA样品进行rnpB基因扩增，均得到大小约为210 bp的扩增片段，与预计大小相符。图1为部分样品扩增结果。

图1 猪源附红细胞体rnpB基因的PCR扩增Fig.1 PCR products of rnpB gene of swine Mycoplasma spp.

2.2 测序结果及分析共获得53条猪源附红细胞体rnpB基因部分序列，其中猪附红细胞体42条，序列长度均为214 bp；小附红细胞体11条，序列长度均为210 bp。利用BioEdit软件（版本号7.0.9.0）对序列进行Clustal W分析。获得的42条猪附红细胞体序列，剔除彼此间完全相同的序列26条，最终剩余16条序列，其代表性编号为：JD-9、JD-11、JD-12、JD-28、JD-30、JD-32、JD-33、JD-50、SJ-2、SJ-5、SJ-14、SJ-142、SJ-157、SJ-159、SJ-162、SJ-169；获得的11条小附红细胞体基因序列完全相同，其代表性序列编号为CN-180。

与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株部分rnpB基因序列（登录号：EF523602）相比，获得的16条猪附红细胞体rnpB基因序列共有15处碱基发生突变（图2），特别是在基因第114位，有13条序列同时发生突变，由胞嘧啶（cytosine，C）突变为腺嘌呤（adenine，A）；另外，JD-12分离株在第149位由胸腺嘧啶（thymine，T）变成腺嘌呤，SJ-169株在第106位由鸟嘌呤（guanine，G）变成腺嘌呤，即都是由其他3种碱基突变为腺嘌呤。JD-50株和SJ-5株的第35位碱基，JD-30株和SJ-14株的第64位碱基，JD-32株的第71位、112位碱基，JD-11株的第116位碱基，SJ-162株的第133位碱基都由腺嘌呤突变成鸟嘌呤。而SJ-159株的第55位碱基，SJ-142株的第80位碱基，JD-30株、SJ-157株、SJ-169株的第118位碱基，SJ-142株的第119位碱基，JD-28株的第148位碱基，SJ-2株的第175位碱基都由胸腺嘧啶变成胞嘧啶。不同猪附红细胞体分离株间rnpB基因种内核苷酸序列的相似性为98.1%～100.0%（图3）。

图2 猪附红细胞体和小附红细胞体不同分离株rnpB基因核苷酸序列的比对Fig.2 Nucleotide sequence alignment of rnpB gene from M. suis and M. parvum isolates

获得的小附红细胞体CN-180分离株与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）相比，共发生4个碱基的缺失（图2）。另外，还有18处发生碱基突变，其中有8处是胸腺嘧啶与胞嘧啶之间的互换，有8处是腺嘌呤与鸟嘌呤之间的互换，还有2处分别是腺嘌呤突变成胸腺嘧啶与胞嘧啶，两者序列的相似性为91.0%；而与16条猪附红细胞体上海分离株rnpB基因相比，种间核苷酸序列的相似性为90.0%～91.0%（图3）。所获得的16条猪附红细胞体和1条小附红细胞体上海分离株rnpB序列均已递交GenBank，登录号为KJ637150～KJ637165。

图3 猪附红细胞体和小附红细胞体不同分离株rnpB基因核苷酸序列相似性比较Fig.3 Nucleotide acid sequences homologies of rnpB gene from M. suis and M. parvum isolates

2.3 猪源附红细胞体rnpB基因的系统进化分析猪附红细胞体rnpB基因序列和小附红细胞体rnpB基因序列分布在2个不同的聚簇上。其中，从上海市分离获得的16条猪附红细胞体rnpB基因序列与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）分布在一个大的聚簇上，该聚簇又分成3个相对独立的聚簇，其中JD-12、JD-28、JD-30、JD-33、SJ-2、SJ-14、SJ-142、SJ-157、SJ-159、SJ-162、SJ-169组成一个分支；JD-9、JD-11、JD-50、SJ-5与德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）在同一分支上；而JD-32单独组成一个分支。小附红细胞体CN-180 rnpB基因序列在另外一个不同的分支上，与GenBank下载的其他小附红细胞体rnpB基因共同组成一个聚簇（图4）。

图4 猪附红细胞体与小附红细胞体rnpB基因部分核苷酸序列的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on partial nucleotide sequences of rnpB gene from M.suis and M.parvum

3 讨论

本研究根据GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）设计引物，对上海市附红细胞体感染猪血液样品DNA进行扩增，共获得了53条猪源附红细胞体rnpB基因部分序列，其中猪附红细胞体42条，小附红细胞体11条。剔除彼此间完全相同的序列，最终获得16条猪附红细胞体rnpB基因序列，1条小附红细胞体rnpB基因序列。

在对16株猪附红细胞体rnpB基因进行种内突变分析时发现，不同猪附红细胞体分离株rnpB基因间核苷酸序列的变异率为0%～1.9%。多数序列在基因第114位同时由胞嘧啶突变为腺嘌呤，也有个别位点序列由其他碱基突变为腺嘌呤。其余个别序列在个别位点也零星发生突变，但很有规律，都是由腺嘌呤转换成鸟嘌呤或者由胸腺嘧啶转换成胞嘧啶。即多数序列位点集中由胞嘧啶突变为腺嘌呤，而个别序列的零星突变都是嘌呤与嘌呤间、嘧啶与嘧啶间的转换。序列同源性比较以及系统进化树分析发现从上海市嘉定区采集的样品JD-9的rnpB基因序列与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）核苷酸序列100%相似，其余序列变异率为0.5%～1.9%，差异都不显著，说明rnpB基因进化过程中受地域等因素影响较小，在该病的两个流行地—欧洲与亚洲地域间差异不大。

小附红细胞体CN-180分离株与猪附红细胞体分离株相比，共发生4个碱基的缺失，其中3个腺嘌呤的缺失是连续的。共发生18处碱基的突变，且几乎都是嘧啶与嘧啶、嘌呤与嘌呤间的转换，且转换频率基本相等，仅个别位置发生腺嘌呤与嘧啶间的颠换。与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列（登录号：EF523602）相比，核苷酸序列的变异率为9.0%；与16条猪附红细胞体rnpB基因核苷酸序列种间变异率为9.0%～10.0%，说明这两个种有明显的差异。

以往的研究中，人们主要是根据猪附红细胞体和小附红细胞体的形态和致病性的不同将它们区别开来[12,13]。随着小附红细胞体16S rRNA基因及rnpB基因的公布，也可以通过分子手段将其与猪附红细胞体鉴别开来。为了进一步评估猪源附红细胞体两个种间遗传进化关系以及碱基改变是否导致密码子编码错误，Watanabe等[14]依据Zuker和Stiegler算法比较了猪源附红细胞体两个种不同分离株株rnpB基因次级结构，发现它们都存在GAAA tetraloop模块（即tetraloop受体），该模块在核糖酶作用过程中起着重要作用。结果显示，这两个种的RNA酶P RNA二级结构茎部区域核酸碱基对是可变的，可以形成一个稳定的次级结构，使自由能最小化。模块核苷酸碱基对的替换导致进化的改变，可能产生新的基因型或物种。

由rnpB基因编码的核糖核酸酶P是具有酶活性的核糖核蛋白复合体，它普遍存在于各种生物体中，催化前体tRNA 5'端的成熟。相比16S rRNA基因，rnpB基因具有相对较高的核苷酸变异率，更适合用于分类单元相近物种间的系统发育分析。Tapp等[15]对链球菌属（Streptococcus）的50个典型菌株和20个其他菌种进行了rnpB基因的序列测定，结果证明rnpB基因适合用于分类单元接近细菌的系统进化分析，有可能成为物种鉴定的一种工具。Peters等[16]对部分动物源附红细胞体和其他支原体进行了部分rnpB基因的PCR扩增，并进行种型鉴定，系统进化分析表明所有的动物源附红细胞体都在同一个分支上，且与厌食支原体（Mycoplasma fastidiosum）接近，这与其16S rRNA 系统进化分析鉴定结果相同。Watanabe等[14]用16S rRNA基因对6株猪源附红细胞体阳性菌株进行系统进化分析，发现这6株菌株分别位于猪附红细胞体聚簇和另一个新簇上，进一步分析新簇所在菌株的rnpB基因初级和二级结构，发现其与猪附红细胞体有明显区别，证明其可能属于小附红细胞体或者另一个新种。本研究对上海市分离的16株猪附红细胞体rnpB基因序列、1条小附红细胞体rnpB基因序列，以及GenBank下载的多株猪附红细胞体和小附红细胞体分离株进行系统发育分析。结果显示，猪附红细胞体rnpB基因序列和小附红细胞体rnpB基因序列分别分布在2个不同的聚簇上，其中，猪附红细胞体rnpB基因组成一个大的聚簇，该聚簇由3个分支构成；而小附红细胞体rnpB基因序列组成另外一个单独的聚簇（图4），有效地区分了猪附红细胞体和小附红细胞体，证明该基因序列可以用于猪源附红细胞体种间的鉴别，其鉴别结果与基于16S rRNA基因的种型鉴定结果一致。而且由于其序列较短，更利于进行基因的扩增、克隆和测序，增加了反应的特异性，可以方便地用于田间猪源附红细胞的鉴别。

综上所述，本研究对经上海市田间分离的猪附红细胞体和小附红细胞体rnpB基因进行了序列测定和比较，丰富了该基因序列信息，为进一步了解其变异状况，鉴别猪源附红细胞体种类和准确诊断附红细胞体病打下基础。下一步将克隆和分析感染人和其他畜禽的附红细胞体rnpB基因，观察其能否广泛地应用于各种动物感染的附红细胞体的鉴别诊断，以扩大其应用范围。

[1] 坎布南 R E, 吉本斯 N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京: 科学出版社, 1984: 1268-1270.

[2] 黑根 W A, 布隆那尔 D W. 家畜传染病学[M]. 北京: 科学出版社, 1988: 348-352.

[3] Riley V. Synergism between a lactate dehydrogenaseelevating virus andEperythrozoon coccoides[J]. Science, 1964, 146(3646): 921-923.

[4] 危洪升. 浅谈猪附红细胞体病及其混合感染[J]. 安徽农学通报, 2010, 16(21): 129-130.

[5] 尚德秋, 李兰玉, 栾景辉, 等. 附红细胞体感染人畜的流行病学调查[J]. 中华流行病学杂志, 1995, 16(3): 143-146.

[6] Neimark H, Johansson K E, Rikihisa Y,et al. Proposal to transfer some members of the generaHaemobartonellaandEperythrozoonto the genusMycoplasmawith the descriptions of ‘CandidatusMycoplasma haemofelis’,‘CandidatusMycoplasma haemomuris’, ‘CandidatusMycoplasma haemosuis’ and ‘CandidatusMycoplasma wenyonii’[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 51(Pt 3): 891-899.

[7] Neimark H, Johansson K E, Rikihisa Y,et al. Revision of haemotrophicMycoplasmaspecies names[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2002, 52(Pt 2): 683.

[8] Splitter E J.Eperythrozoon suisn. sp. andEperythrozoon parvumn.sp., two new blood parasites of swine[J]. Science, 1950, 111(2889): 513-514.

[9] Messick J B, Cooper S K, Huntley M. Development and evaluation of a polymerase chain reaction assay using the 16S rRNA gene for detection ofEperythrozoon suisinfection[J]. J Vet Diagn Invest, 1999, 11(3): 229-236.

[10] Wilson K H, Blitchington R B, Greene R C. Amplification of bacterial 16 S ribosomal DNA with polymerase chain reaction[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(9): 1942-1946.

[11] Weisburg W G, Barns S M,Pelletier D A,et al.16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J Bacteriol, 1991, 173(2): 697-703.

[12] Splitter E J.Eperythrozoon parvum, a filterable blood parasite of swine[J]. Nature, 1953, 172(4366): 40.

[13] Seamer J. Studies withEperythrozoon parvumSplitter, 1950[J]. Parasitology, 1960, 50(1-2): 67-80.

[14] Watanabe Y, Fujihara M,Obara H. Two genetic clusters in swine hemoplasmas revealed by analyses of the 16S rRN A and RNase P RNA genes[J]. J Vet Med Sci, 2011, 73(12): 1657-1661.

[15] Tapp J, Thollesson M,Herrmann B. Phylogenetic relationships and genotyping of the genusStreptococcusby sequence determination of the RNase P RNA gene,rnpB[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(Pt6): 1861-1871.

[16] Peters I R, Helps C R, McAuliffe L,et al. RNase P RNA gene(rnpB)phylogeny of hemoplasmas and otherMycoplasmaspecies[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(5): 1873-1877.

CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF RNPB GENE OF MYCOPLASMA SPP. ORIGIN OF SWINE

WANG Xiang-pei1,2, ZHOU Peng2, MI Rong-sheng2, SHEN Li-ping3, HUANG Yan2, WANG Xiao-juan1,2, YANG Xiao-jiao2, SHI Kai2, LIU Yu-xuan2, LEI Xiao-si2, CHEN Zhao-guo2, ZHAO Quan1
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Animal-borne Food Safety Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3. Shanghai Center of Animal Disease Control, Shanghai 201103, China)

The present study was designed to illustrate variation of RNase P RNA (rnpB) gene ofMycoplasmaspp. origin of swine. PartialrnpBgene ofMycoplasma suisandM.parvumwas amplifi ed in PCR from 53 genomic DNAs extracted from pig blood samples, which had been identifi ed asMycoplasmaspp. positive by 16S rRNA gene sequence analysis. The amplifi ed products were cloned into pMD18-T vector for sequencing. The obtained sequences were compared with the sequence ofrnpBgene ofM. suisGerman isolate in GenBank (Accession number：EF523602). The phylogenetic tree was constructed based on nucleotide sequence ofrnpBgene ofdifferent species using MEGA 5.0 software and the results ofMycoplasmaspecies identification were compared with those of 16S rRNA assessment. Total 42rnpBgenes of differentM. suisisolates and 11rnpBgenes of differentM. parvumisolates were cloned and sequenced. Homology analysis showed that the nucleotide sequence identities were 98.1%-100.0% betweenM. suis rnpBgene of Shanghai isolates and German isolate, 91.0% betweenrnpBgene ofM. parvumShanghai isolates and German isolate and 90.0%-91.0% betweenM. parvumandM. suisShanghai isolates. ThernpBgenes ofM. suisandM. parvumdistributed in different clusters of phylogenetic tree, which was consistent with 16S rRNA gene assessment.

Mycoplasma suis;M. parvum; rnpBgene; cloning; sequence alignment

S852.64

1674-6422（2014）03-0026-08

2014-03-17

公益性行业（农业）科研专项项目（200903036）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2014JB04）

王向佩，女，硕士研究生，预防兽医学专业

陈兆国，E-mail: zhaoguochen@shvri.ac.cn；赵权，E-mail: zhaoquan0825@163.com