鸡传染性支气管炎强毒分离株遗传进化分析和免疫保护试验

胡北侠，黄庆华，杨少华，许传田 ，张 伟，张 琳，王莉莉，黄艳艳，张秀美

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南250100；2.山东省微山畜牧局，微山277600）

鸡传染性支气管炎（infectious bronchitious，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitious virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染性疾病。IBV基因组为单股正链RNA，长约27.6 kb，编码4种结构蛋白：即纤突蛋白（spike protein，S）、基质蛋白（membrane protein，M）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）和膜蛋白（envelope，E）[1,2]。S蛋白位于IBV粒子的表面，由S1和S2两个亚单位组成，S1蛋白是血清中和抗体的主要诱导者，并与病毒的组织嗜性和免疫保护密切相关[2,3]。

疫苗免疫是鸡传染性支气管炎的主要防控措施之一，但由于IBV很容易通过基因突变、插入、缺失和重组发生变异，给此病的免疫预防不断带来新的挑战。近年来，IBV对山东养鸡业（特别是商品肉鸡）的危害日益严重。虽然H120、MA5和491等多种IB弱毒活疫苗用于该病的免疫预防，临床上仍然经常发生IBV的感染，造成巨大经济损失。本实验室2012年从山东省发病鸡群分离鉴定了1个IBV强毒株SDIB821/2012，为了明确该流行株的分子特征，对其S1基因进行了测序和遗传进化分析。此外，选择3个常用IB弱毒活疫苗进行了免疫保护试验，为明确鸡群不断发生IB免疫失败的原因和有效防控本病提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 病毒、SPF鸡胚和SPF鸡 IBV分离株SDIB821/2012从山东省某商品肉鸡群分离，该鸡群于7日龄用IB活疫苗H120滴鼻、点眼免疫，10日龄左右鸡群开始发病，主要病理变化为气管出血、肾脏肿大和心脏等内脏器官表面大量尿酸盐沉积，累计死淘率60%左右。动物回归试验结果显示，SDIB821/2012（以105.0EID50滴鼻）对14日龄SPF鸡致死率60%，病死鸡病理变化与临床发病鸡群基本一致。

9～11日龄SPF鸡胚、3日龄SPF鸡购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。SPF鸡于隔离器内饲养，饲料和饮水均经无菌处理。

1.2 鸡传染性支气管炎疫苗 鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗491和MA5均为Nobillis公司生产；H120 为国内某生物制品厂生产。

1.3 引物、菌种、质粒和试剂 S1基因引物序列参考文献[4]，由上海生物工程有限公司合成；pEASY-T1载体购自北京全式金公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、Trizol和Gel Extraction Kit均购自大连宝生物工程有限公司；DH5α菌种为本实验室保存；IBV抗体ELISA检测试剂盒为IDEXX公司生产；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.4 IBV分离株S1基因的扩增、克隆与测序 按TRIzol试剂（Invitrogen）说明书提取病毒基因组RNA。应用RT-PCR 方法，扩增病毒S1基因。将回收后的PCR 产物与pMD18-T 载体进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经菌液PCR 鉴定后，委托北京六和华大基因科技股份有限公司测序。

1.5 IBV分离株S1基因核苷酸序列的比较分析 利用lasergene7.0和MEGA 4.1生物软件，将SDIB821/2012的S1基因分别与本实验室分离的IBV流行株和GenBank中国内外IBV参考株进行同源性比较和系统进化分析。

1.6 IB弱毒活疫苗对SDIB821/2012的免疫保护试验

1.6.1 试验鸡分组与免疫 3日龄SPF鸡60只，随机分成4组（A、B、C、D），每组15只。A、B和C组为免疫组，于3日龄通过滴鼻、点眼途径免疫IB弱毒活疫苗（1羽份/只），D组为对照组，以相同剂量无菌0.01 mol/L PBS缓冲液（pH7.2）滴鼻、点眼。

1.6.2 试验鸡攻毒 免疫后14 d，免疫组和对照组试验鸡分别用IBV分离株SDIB821/2012攻毒，攻毒剂量为105EID50/只，攻毒方式为滴鼻。攻毒前各组试验鸡分别随机取3只扑杀，采集气管组织和泄殖腔棉拭进行疫苗株排毒检测，同时采集血清分别检测ELISA抗体和针对SDIB821/2012的中和抗体。

1.6.3 试验鸡临床症状及发病死亡情况 攻毒后共观察14 d，每天观察试验鸡食欲、精神、是否有呼吸道等临床症状，病死鸡剖检观察主要病理变化。记录各组试验鸡发病死亡情况。

1.6.4 试验鸡攻毒后排毒检测 分别于攻毒后3、5、7 d对各组试验鸡采集喉头和泄殖腔棉拭，接种SPF鸡胚，进行病毒分离，每组每次采3只。对病死鸡取气管、肺脏和肾脏组织进行病毒分离，每组累计取3只（若无试验鸡死亡，于d7扑杀3只取样）。

表1 试验鸡分组和攻毒后发病死亡情况Table 1 Experiment design and results of vaccination-challenge test

2 结果

2.1 分离株SDIB821/2012S1基因遗传进化分析和同源性比较 SDIB821/2012毒株S1基因长度为1620 bp，编码540个氨基酸（含裂解位点）。遗传进化分析发现，包括SDIB821/2012在内的 13个山东IBV流行株（黑色三角形标注）与国内外参考株和疫苗株形成4个进化分支（图1），SDIB821/2012与12个山东分离株均属于以参考株QXIBV为代表的基因Ⅰ型（QX-like）。基因Ⅱ型包括491疫苗株和3个参考株，基因Ⅲ型包括疫苗株H120、2886、MA5和M41。基因Ⅳ型包括4个国内分离株，其中YN株是一个IBV强毒株，对30日龄SPF鸡致死率为65%[5]。S1基因序列比较结果显示SDIB821/2012与同属于基因Ⅰ型的参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为93.4%～99.3%和91.6%～98.5%，与疫苗株H120和MA5同源性均为76.9%和74.8%，与491同源性为78.4%和77.6%，与强毒株YN同源性为80.7%和80.4%。

2.2 试验鸡免疫后14 d抗体滴度与气管、泄殖腔疫苗株病毒检测情况 各免疫组试验鸡于攻毒之前每组取3只，扑杀后取气管组织、泄殖腔棉拭和血清样品进行病毒和抗体检测。结果显示各组试验鸡免疫后14 d，气管组织和泄殖腔棉拭存在不同程度排毒，说明IB疫苗免疫后14 d仍然在鸡群中存在。抗体检测结果显示各组试验鸡免疫后14 d ELISA抗体和针对SDIB821/2012的中和抗体均为阴性。对照组（D组）气管和泄殖腔病毒检测阴性，ELISA和中和抗体阴性（表2）。

2.3 试验鸡攻毒后临床症状及发病死亡情况 试验鸡攻毒后d2个别鸡出现精神沉郁，d3开始出现死亡，d4～6达死亡高峰，病死鸡表现气管出血、粘液，肾脏花斑肾，肝脏、肺脏充血、部分病死鸡心脏表面有白色尿酸盐（图略），与临床发病鸡群病理变化基本相同。d7存活鸡精神基本恢复。各组试验鸡发病死亡情况见表1。

2.4 试验鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭以及内脏组织病毒分离结果 对免疫组、对照组d3、5、7试验鸡喉头和泄殖腔棉拭样品以及病死鸡气管、肾脏和肺脏组织样品进行病毒分离。检测结果显示，491、MA5和H120免疫组和对照组喉头、泄殖腔棉拭和内脏组织病毒均可检测到病毒（表3）。

图1 IBV分离株SDIB821/2012与参考株 S1基因（1611 bp）遗传进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of SDIB821/2012 and reference strains based on S1 gene sequences using neighbor-joining method ( Mega 4.1)

表2 试验鸡免疫后14 d疫苗株气管、泄殖腔排毒和抗体检测结果Table 2 Shedding of IBV and antibody detection in trachea and cloacal of chicdens at 14 days post vaccination

表3 试验鸡攻毒后喉头、泄殖腔棉拭和内脏器官排毒检测结果Table 3 The result of IBV shedding in laryngeal, cloacal and some internal organs of chickens challenged with SDIB821/2012

3 讨论

近年来，IBV对山东省商品肉鸡的危害越来越严重。SDIB821/2012是本实验室2012年从山东省某发病的商品肉鸡分离的毒株。免疫保护试验中对照组17日龄SPF鸡用SDIB821/2012攻毒后2 d开始出现精神沉郁，3～6 d死亡率约为67%（8/12），且病死鸡临床症状和病理变化与临床发病鸡群基本一致，表明SDIB821/2012致病性较强。

遗传进化分析结果显示，SDIB821/2012属于以QXIBV为代表的基因Ⅰ型。此类IBV于1997年首次在我国青岛市发病鸡群中分离，现在是国内IBV流行株的主要基因型[6,7]，而且亚洲和欧洲多个国家均有此类毒株的流行[8-10]，表明此类IBV毒株具有广泛的传播能力，应引起足够的关注。YN毒株也是一个IBV强毒株，2005年从云南省某发病鸡群中分离，研究发现YN对30日龄SPF鸡的致死率为65%[5]。遗传进化分析显示YN属于基因Ⅳ型，与SDIB821/2012遗传距离较远，S1基因核苷酸同源性为80.7%，表明二者具有不同的进化来源。

IB疫苗对SDIB821/2012免疫保护试验结果显示，根据攻毒后各组试验鸡发病死亡情况，491对流行株SDIB821/2012免疫保护率最高（90%），MA5和H120对SDIB821/2012保护率仅为33%和40%。国内外相关研究也证明H120活疫苗对QX基因型流行株免疫效果不理想[11,12]，与本研究结果相符。各免疫组试验鸡攻毒后喉头、泄殖腔棉拭以及气管、肾脏和肺脏组织均可检测到病毒。而国外学者Terregino等[3]研究发现，SPF鸡用IB活疫苗491和MA5分别于1日龄和14日龄免疫后能够抵抗QX基因型IBV流行株的攻击，免疫鸡群攻毒后没有明显的临床症状，气管和肾脏组织也检测不到病毒。造成本研究结果与之差异的原因可能在于免疫程序、攻毒毒株和剂量不同，有必要通过相关试验进一步验证。

抗体检测结果显示，SPF鸡用3种IB弱毒活疫苗免疫后14 d，ELISA抗体和针对SDIB821/2012的中和抗体均为阴性，而491免疫组攻毒后具有90%的临床保护率，表明对于IBV弱毒活苗而言，细胞免疫和局部的粘膜免疫在抗病毒感染中起主要作用。

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