正畸力作用下大鼠牙髓组织中热休克蛋白70的表达及意义

苏士文 赵紫婷 程哲

●临床研究

正畸力作用下大鼠牙髓组织中热休克蛋白70的表达及意义

苏士文 赵紫婷 程哲

目的 检测正畸力作用下大鼠牙髓组织中热休克蛋白70（Hsp70）的表达和分布，探讨其在正畸移动中的作用和机制。方法建立大鼠正畸牙移动模型，分别在受力1、15、30d处死，制备左侧上颌第一磨牙及其周围牙槽骨的石蜡标本，采用免疫组织化学法检测大鼠正畸牙移动过程中牙髓组织中Hsp70的表达情况。结果正常对照组、正畸加力1d组、正畸加力15d组和正畸加力30d组牙髓组织中Hsp70表达量分别为4．02±0．03、28．13±0．23、10．02±0．08、5．23±0．42，正畸加力1d组大白鼠牙髓组织中Hsp70表达量显著高于正常对照组（P＜0．01），正畸加力15d组和正畸加力30d组与正常对照组的差异无统计学意义（P＞0．05）。结论Hsp70参与了正畸牙移动，并且保护了牙髓组织。

热休克蛋白70 免疫组化 正畸力

热休克蛋白（Hsp）又称应激蛋白，是普遍存在于生物体细胞中在热休克状态下启动的一系列特殊基因编码合成的蛋白质。其中Hsp70有两种同源体：Hsc70和Hsp70，Hsc70在正常牙髓组织中即有表达称为结构型，而Hsp70在应激状态下才有表达又称诱导型，也是口腔医学中关于牙髓损伤修复极为重要的一种Hsp。正畸治疗初期很多患者会出现疼痛不适症状，严重者影响进食和情绪，甚至会出现敏感的牙体冷热反应及咬合痛等而终止治疗。目前，关于正畸力对牙齿的影响也仅局限于对牙周组织的研究，正畸力对牙髓组织的影响罕有报道。本研究采用免疫组织化学方法观察Hsp70在正畸力作用下不同时段其在牙髓组织中的动态表达及定位情况，旨在探讨正畸力作用下Hsp70在牙髓抗损伤作用中的表达及意义。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：48只6周龄SPF级（无特定病原体动物）健康雄性Wistar大白鼠，由温州医科大学动物试验中心提供，体重（220±10）g，适应性饲养1周。试剂：鼠抗人Hsp70单克隆抗体，二步法免疫组化试剂盒（A瓶：Chem-Mate EnVision+/HRP，兔/小鼠；月瓶：DA月缓冲稀释液；C瓶：DA月原液），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组及造模 将48只大白鼠随机分为正常对照组、正畸加力1d组、正畸加力15d组和正畸加力30d组。采用加力方法对实验组大白鼠左侧上颌第一磨牙施以0.49N近中向正畸力，建立正畸牙移动的模型。正常对照组左侧上颌第一磨牙只安装加力装置而不施加力作用。观察比较4组大白鼠受力后变化。所有动物分别在加力后各时点处死，取含左侧上颌第一磨牙及其周围牙槽骨的组织块，放入10%甲醛溶液中4℃固定24h，脱钙、脱水、石蜡包埋。

1.3 免疫组化染色 按试剂盒说明进行：常规脱蜡水化；胰酶法修复抗原；阻断内源性过氧化物酶活性；滴加50～100μl一抗工作液于组织上，室温孵育30min，用P月S冲洗切片，浸泡5min，重复3次。取出切片，擦干组织周围的液体，平放于湿盒中；滴加50～100μl A液（ChemMateTMEnVision+/HRP）于组织上，室温孵育30min；滴加预备好的显色剂DA月工作液50～100μl，室温孵育5～10min，或光镜下控制显色；显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色；需要时，苏木精复染；脱水、透明、封片、显微镜观察。

1.4 Hsp70表达判定及定量分析 Hsp70在细胞核及细胞质内均可表达，出现棕黄色即判定为阳性。免疫组化结果根据阳性细胞的百分率和阳性细胞数进行半定量处理。阳性细胞百分率＜5%为阴性，6%～30%为弱阳性，31%～60%为阳性，≥60%为强阳性，以阳性和强阳性为过表达。应用MIAS-300全自动分析仪，将免疫组化染色的切片在光镜下统一放大200倍，每张切片上随机选取5个视野进行细胞着色的统计学分析，计算机自动测量阳性细胞Hsp70的表达含量。

1.5 统计学处理 采用PASW statisticsl8统计软件，所得计量资料均采用表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果 正常对照组牙髓组织中个别牙髓细胞质弱阳性染色，其余未见阳性表达（图1）。正畸加力1d，牙髓成牙本质细胞及其相邻成纤维细胞为阳性表达，部分细胞核着色，可见血管内皮细胞弱阳性表达（图2）。正畸加力15d，牙髓组织中个别牙髓细胞质弱阳性染色，可见血管内皮细胞弱阳性表达（图3）。正畸加力30d，牙髓组织中个别牙髓细胞质弱阳性染色，其余未见阳性表达（图4）。

图1 正常组牙髓组织（免疫组化染色，×200，下同）

图2 正畸力1d牙髓组织

图3 正畸力15d牙髓组织

图4 正畸力30d牙髓组织

2.2 各组大白鼠牙髓组织中Hsp70表达量的比较 正常对照组、正畸加力1d组、正畸加力15d组和正畸加力30d组牙髓组织中Hsp70表达量分别为4.02±0.03、28.13±0.23、10.02±0.08、5.23±0.42，正畸加力1d组大白鼠牙髓组织中Hsp70表达量显著高于正常对照组（P＜0.01），正畸加力15d组和正畸加力30d组与正常对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

Hsps作为一种非特异性的细胞内源性保护蛋白，Hsp70是其中最主要的一种，其重要的功能是参与耐受的形成。当细胞或组织受到应激时，Hsp70生成显著增加，避免机体再次应激时遭受更为严重的损伤[1]。90年代初Sens等即已经发现Hsp在牙髓中表达，之后吕平等[2]报道了Hsp70在龋病中的表达，而赵紫婷等[3-4]也报道了Hsp在大鼠及人急慢性牙髓炎中的表达。另外，笔者的前期研究也发现人牙髓在正畸力作用下Hsp的表达[5]。

Hsp70作为分子伴侣的主要功能是清除细胞内积聚的异常蛋白，当牙体组织受到外界有害因素的不断刺激后，成牙本质细胞即会受到不同程度的损害，使细胞内蛋白的合成受到影响，导致大量异常折叠的蛋白在细胞内积聚[6]。这些异常的蛋白可能即是引起热休克反应的发起点，促使牙齿硬组织在受到程度不同的正畸力后，使牙髓组织合成更多的Hsp70与积聚的异常蛋白相互作用将其清除。

本研究结果显示，在大鼠磨牙受正畸力1d后，牙髓组织中出现Hsp70的阳性表达，与正常组比较差异有统计学意义，在正畸力加力1d后Hsp70表达量达高峰，此时可以看到中性粒细胞呈阳性表达。在大鼠磨牙受正畸力15d后，牙髓组织中出现Hsp70的弱阳性表达，可能是细胞受到正畸力后期，大量的异常蛋白引起机体内Hsp70合成的大量增加。随着正畸力的逐渐减退，细胞内异常蛋白的积累减少，牙髓细胞感受到这种变化，逐渐减少Hsp70的表达水平。此后，随着牙髓组织内异常蛋白的清除，Hsp70的表达逐渐减少。至正畸加力30d后，胞核和胞质内Hsp70阳性表达水平趋于一致。这与李晓鲁等[7]报道的Hsp70被诱导的数量与其保护作用的强弱呈正相关相符。

综上所述，笔者认为Hsp70可能对反复刺激组织的存活具有重要意义，有目的的提高组织细胞Hsp70的表达水平将可以有效防止机体再次受到更强刺激时细胞功能受到损伤。在口腔正畸力下，应用轻力原则，间隔加力时间最好在1个月以上，可以有效避免牙周、牙髓组织的损伤。

[1]田凤契,郑金平,孙建娅,等．焦化作业工人淋巴细胞Hsp70表达及作用[J]．中国公共卫生,2007,23(2):204-205．

[2]吕平,边专,陈智．热休克蛋白70在人正常牙和龋坏牙牙髓中的免疫定位[J]．牙体牙髓牙周病学杂志,1999,9(4):267-269．

[3] 赵紫婷,王建平,苏士文,等．大鼠磨牙牙髓组织在不同的机械刺激后Hsp70的表达及意义的研究[J]．口腔医学,2010,30(6):339-342．

[4]赵紫婷,张纪纲,李莹．热休克蛋白70在人炎型牙髓组织中的表达及意义[J]．浙江医学,2010,32(6):940-942．

[5]苏士文．LF托槽在活髓牙排齐过程中对牙髓组织的影响[J]．口腔医学, 2010,30(10):602-604．

[6]Terada K,Mori M．Mitochondrial protein import in animals[J]．Biochim Biophys Acta,1998,14(1):12-17．

[7]李晓鲁,彭毅志,袁志强,等．热休克蛋白70基因重组腺病毒载体微胶囊化及口服转染的研究[J]．中华烧伤杂志,2003,19(3):145-147．

Expression of HSP70 in rat molars pulp tissue applied with orthodontic force

Objective To investigate the expression of heat shock protein 70 (Hsp70)in rat molars pulp applied with orthodontic force．MethodsThe animal model for tooth movement was established,and the rats were sacrificed in batches on d1, 15 and 30．The maxillary molars and periodontium specimens were obtained and the expression of Hsp70 was detected by immunohistochemistry．ResultsThe expression of Hsp 70 in control group and d1,d15,d30 orthodontic force groups were 4．02± 0．03 and 28．13±0．23,10．02±0．08,5．23±0．42,respectively．There was significant difference in Hsp 70 expression between control group and D1 orthodontic force group(P＜0．01),while there were no significant differences between control group and D15,D30 groups(P＞0．05)．ConclusionDuring the orthodontic tooth movement,HSP70 might be one of main cytokines in process of reparative dentin mineralization．

Hsp70 Immunohistochemistry Orthodontic force

2013-07-10）

（本文编辑：欧阳卿）

丽水市科技局课题（20110414）

323000 丽水市人民医院口腔科（苏士文、程哲）；丽水市中心医院口腔科（赵紫婷）