APP下载

应用蛋白质组学技术筛选急性心肌梗死早期标志蛋白的研究

2014-04-13张丽谢建洪劳迪波郦卫星陈莹

浙江医学 2014年24期
关键词:质谱心绞痛心肌梗死

张丽 谢建洪 劳迪波 郦卫星 陈莹

应用蛋白质组学技术筛选急性心肌梗死早期标志蛋白的研究

张丽 谢建洪 劳迪波 郦卫星 陈莹

目的 检测急性心肌梗死早期(发病到就诊时间<2h)患者血清中的蛋白表达谱,筛选并鉴定出特异的标志蛋白。方法 选取20例急性心肌梗死早期患者(早期急性心肌梗死组)和40例稳定性心绞痛患者(稳定性心绞痛组),采用激光解析电离飞行时间质谱技术,检测两组患者血清中的蛋白峰强度,寻找差异表达蛋白并建立蛋白分类模式,确定诊断的特异度和敏感度。采用液相质谱技术进一步鉴定已筛选出来的蛋白。 结果 早期急性心肌梗死组有5个蛋白显著高表达,质荷比分别为1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da,与稳定性心绞痛组患者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。建立决策树,早期诊断急性心肌梗死的敏感度为93.33﹪,特异度为85.00%,阳性预测值为93.33%。经过鉴定,phosphoglycerate mutase 1在急性心肌梗死早期患者中高表达。结论 通过蛋白质组学技术可以早期发现急性心肌梗死,phosphoglycerate mutase 1为早期特异表达蛋白。

急性心肌梗死 质谱 生物学标记 蛋白鉴定

急性心肌梗死致死率较高。如果缺少辅助试剂,很难确诊。目前常用的生物学标记一般在发病后2h才能在血液中检出,所以使得很多早期心肌梗死患者无法得到及时治疗。有效的治疗基于迅速准确的诊断。激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术在检测临床疾病时,可直接鉴定生物标志物,优于酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验等间接测定生物标志物的方法[1-2]。本研究拟通过检测早期急性心肌梗死患者(发病到就诊时间<2h)血清中的蛋白指纹图谱,从中筛选出特异的分子标志物,建立诊断急性心肌梗死的蛋白分类模型,从而为急性心肌梗死早期诊断提供依据。同时鉴定发现蛋白峰,进一步探究急性心肌梗死的发病机制,现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择浙江省人民医院2011-08—2012-12住院的早期急性心肌梗死(发病到就诊<2h)患者20例(早期急性心肌梗死组),其中男12例,女8例,年龄42~85(69±10)岁。稳定性心绞痛患者40例(稳定性心绞痛组),其中男23例,女17例,年龄48~83(68±11)岁。诊断根据2011 ACC/AHA诊断标准,均经心肌损伤标志物、心电图、冠状动脉造影确定。通过病史和常规检查排除其他心脑血管疾病。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 SELDI-TOF-MS和蛋白质芯片CM10均购于美国Biorad公司,尿素、二硫苏糖醇(DTT)、3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、芥子酸、三氟乙酸、去离子水、乙腈等试剂均购自美国Sigma公司。质谱为Thermo公司的LCQ Deca Xp plus系统。液质联用串联质谱(LC-MS/MS)液相色谱为Thermo公司的Surveyor系统。

1.2.2 样品处理 早期急性心肌梗死组入院立刻抽取静脉血2ml,稳定性心绞痛组患者入院后第2天清晨抽取静脉血2ml,3 000 r/min离心出血清,-70℃冰箱冻存待测。血清样品解冻后以10 000 r/min,4℃离心5min,将10μl上清与20μl裂解液(9MUrea,2%CHAPS,50mMTris-HCl,pH9.0)充分混匀,在冰盒上振荡孵育30min,加入370μl缓冲液(50mM醋酸钠,pH4.0)稀释,加至蛋白芯片处理器Bioprocessor(美国Biorad公司)中,振荡60min。去掉血清样本,加入200μl的结合缓冲液(50mM醋酸钠,pH4.0),室温置振荡器600r/min震荡5min,弃出液体,重复1次。拆开芯片处理器,取出芯片,干后,在每个加样孔上加芥子酸(0.5%三氟乙酸,50%乙腈)1μl。

1.2.3 芯片阅读设置 将SELDI-TOF-MS系统校正到蛋白分子量误差<0.1%。为避免基质峰对结果造成干扰,将相对分子质量为1 000 Da以下的蛋白质峰滤去,其优化范围为2 000~10 000 Da,读取范围为50 000 Da。芯片阅读的参数设置:激光强度为200,检测灵敏度为8。通过Ciphergen Pmteinchip 3.1软件辅助,利用数字化的操作平台,程序性完成数据读取过程。

1.2.4 蛋白纯化 取100μlWCX磁珠(Bruker)加入1.5ml EP管中,加入醋酸钠缓冲液50mM pH4.0进行活化5min 2次。加入1ml处理好的血清样本震荡孵育30min后弃除上清液,加入100ml 1%甲酸震荡孵育10min后取上清。将上清液放入Millipore超滤离心管10KD中,10 000r/min,20min后取离心管中液体备用。

1.2.5 LC-MS/MS质谱分析 色谱柱为热电公司的BioBasic-18,150x0.18mm,流动相A为H2O+0.1%甲酸,流动相B为乙腈+0.1%甲酸,120min线性梯度洗脱;样品进样量为20μl,流速1μl/min;质谱全扫描范围:m/ z400-2000,MS/MS数据依赖扫描5次。

1.2.6 数据库检索 用上述质谱数据对蛋白质进行数据库检索,检索软件为pFind Ver 2.6,检索参数为:非特异酶切,无修饰位点,前体离子宽度为2 Da,产物离子宽度为0.5 Da。蛋白质数据库为IPI human Ver.3.83,肽段的Score值<1.0E-5才被认为是可靠的[3-4]。

1.3 统计学处理 采用BioMarker Wizard 3.1软件,由峰值强度反映组与组间具有相同质荷比蛋白质的含量差异,对采集图谱进行均一化处理,去噪平滑,过滤信噪比(S/N)<5的蛋白峰。初步筛选出的差异蛋白峰采用BioMarker Pattern 5.0(用的是决策树方法对目标对象进行分类)对数据分组及建立蛋白质峰分类决策树诊断模型,评价该模型的感敏度及特异度。采用SPSS19.0统计软件,计量资料以表示,两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 急性心肌梗死早期差异标志蛋白的筛选结果 与稳定性心绞痛组比较,早期急性心肌梗死组有5个异常蛋白峰,质荷比分别为1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da,见图1。两组蛋白的峰值强度比较,见表1。

表1 两组蛋白的峰值强度比较(%)

由表1可见,两组5个蛋白的峰值强度比较,差异有显著统计学意义(P<0.01),早期急性心肌梗死组5个蛋白均为急性组高表达。

2.2 诊断决策树模型的敏感度、特异度和阳性预测值 见图2-3。

由图2可见,根据这5个蛋白峰1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da建立诊断决策树模型,对两组患者进行分析,早期心肌梗死组的敏感度为93.33%,特异度为85.00%,阳性预测值为93.33%。

图1 5个蛋白在早期心肌梗死组高表达。横坐标为分子量(质荷比),纵坐标为蛋白峰的强度(百分比)

由图3可见,早期心肌梗死组和稳定性心绞痛组的ROC曲线下面积为0.916,>0.9说明诊断价值较高。2.3 LC-MS/MS液质联用分析结果 见图4。

由图4可见,采用LC-MS/MS鉴定肽段,其总离子流图提示具有相当高丰度的肽段,经过LC-MS/MS分析,得到相应的肽段序列。将所有鉴定出的肽段序列,经过BIoworks软件搜索IPIhuman蛋白质数据库,确定吻合率最高的蛋白质为候选差异蛋白质,即phosphoglycerate mutase 1。其中与phosphoglycerate mutase 1蛋白质吻合的肽段数有20个,排除重复的肽段,独特性的肽段数有8个。

3 讨论

急性心肌梗死属于临床常见疾病之一,其发病原因为患者体内冠状动脉血管出现闭塞,且此闭塞现象为急性,导致患者冠状动脉血流情况发生中断,心肌发生缺血导致坏死。其临床表现为心律失常、具有持久性的胸骨后疼痛、休克以及心力衰竭等,若患者未得到及时有效的治疗措施,将发生严重后果,预后效果较差,甚至致其死亡。因此,临床对于急性心肌梗死患者进行治疗时,正确的诊断患者病情并采取有效的治疗措施是抢救患者生命的关键因素。研究表明,近年来随着人们生活习惯的不断改变,急性心肌梗死疾病的临床发生率呈现出显著上升趋势,严重影响患者生活质量与生命安全。目前常用的心肌损伤标志物包括:肌红蛋白:胸痛发作后2~4h开始升高,肌酸激酶同工酶(CK-MB)4h、肌钙蛋白(cTNI/cTNT)4~8h、AST 6~7h、乳酸脱氢酶(LDH)8~10h开始升高。

图2 两组决策树模型图

图3 两组ROC曲线下面积(A:ROC稳定性心绞痛组,B:ROC早期心肌梗死组)

图4 总离子流图

蛋白质芯片结合SELDI-TOF-MS技术是近年来发展起来的一种蛋白质组学研究技术,它将蛋白质芯片(或磁珠)技术与质谱技术相结合,通过引入基质分子,使待测分子不产生碎片。与传统技术相比,能高通量、高效率、高灵敏度的检测微量粗制样本中的差异蛋白,可在短时间内利用0.5~400μl样本得到fmol(10~15mol)数量级的质荷比在500~500 000Da的蛋白质肽质量指纹图谱,已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具[3-4]。已广泛用于肿瘤及非肿瘤性疾病[5]。

本研究则通过蛋白质芯片和飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)在早期急性心肌梗死患者和稳定性心绞痛患者之间找到5个蛋白质峰1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da有统计学意义,并用BioMarker Patterns构建急性心肌梗死早期患者血清学诊断模型,其敏感度为83.6%,特异度为90%,阳性预测值为90.2%。张更谦等[6]用SELDI-ToF-Ms观察大鼠急性心肌缺血后心肌蛋白质谱的变化规律,筛选心肌缺血的蛋白标记物。大鼠心肌组织中6 304、8 337、8 375Da蛋白峰都是急性心肌缺血后的较为特异性改变,可在心肌缺血后5min内出现,有可能作为心肌缺血的蛋白标记,亦可能用于心肌缺血和法医学心源性猝死的诊断。Menger[7-8]也发现通过SELDI可检测到急性心肌梗死患者血清中磷酸化的肌钙蛋白存在。这些均为心血管疾病的早期诊断提供依据。同时,本研究中对其中急性心肌梗死患者早期高表达的质荷比23 386.1Da蛋白进行LC-MS/MS液质联用串联质谱分析,结果质荷比23 386.1Da为phosphoglycerate mutase 1。PGAM是一种重要的糖酵解酶,具有分子内转移酶活性,与碳水化合物转运、新陈代谢、催化活性及生长发育有关。可以催化3-磷酸甘油酸盐转化为2-磷酸甘油酸盐。在肿瘤细胞中,PGAM可调节糖酵解与其他ATP产生通路以及糖异生之间的平衡。目前对该酶进行的研究较少,尚无对某种生物PGAM的深入研究[9-10]。但本研究中,phosphoglycerate mutase 1在急性心肌梗死患者早期的高表达可用于作早期诊断的生化学标记,其在急性心肌梗死过程中的产生、变化机制有对于进一步深入研究。

[1]Wang L H,Li D Q,Fu Y,et al.pFind 2.0:a software package for peptide and protein identification via tandem mass spectrometry [J].Rapid Commun Mass Spectrom,2007,21(18):2985-2991.

[2]郦卫星,吴含.血清蛋白指纹图谱技术筛查前列腺癌患者特异性血清标志物的应用价值[J].浙江医学2012,37(7):512-514.

[3]Cieniewski-Bernard C,Acosta A,Dubois E,et al.Proteomic analysis in cardiovascular diseases[J].Clin Exp Pharmacol Physiol, 2008,35(4):362-366.

[4]Wang B H,Reisman S,Bailey M,et al.Peptidomic profiles of post myocardial infarction rats affinity depleted plasma using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight(MALDI-ToF) mass spectrometry[J].Clin Transl Med,2012,15(1):1-8.

[5]Menger R F,Stutts W L,Anbukumar D S,et al.MALDI mass spectrometric imaging of cardiac tissue following myocardial infarction in a rat coronary artery ligation model[J].Anal Chem,2012,84(2): 1117-1125.

[6]张更谦,周斌.心肌缺血早期表达蛋白的质谱研究[J].中国法医学杂志, 2008,23(2):82-85.

[7]Li X F,Jiang Y R,Gao Z Y,et al.Screening identification and analysis of platelet differential functional proteins in patients with coronary heart disease of blood-stasis pattern[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2010,30(5):467-473.

[8]Jong H J,Adhya M,Park H M,et al.Detection of Hanganutziu-Deicher antigens in O-glycans from pig heart tissues by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Xenotransplantation,2013,20(6):407-417.

[9]Chen T S,Chang M H,Kuo W W,et al.MALDI-TOF mass spectrometry analysis of small molecular weight compounds(under 10 KDa)as biomarkers of rat hearts undergoing arecoline challenge [J].Pharm Biol,2013,51(4):488-491.

[10]Jiang X,Sun Q,Li H,et al.The role of phosphoglycerate mutase 1 in tumor aerobic glycolysis and its potential therapeutic implications[J].Int J Cancer,2014,135(9):1991-1996.

Screening of early marker proteins for acute myocardial infarction by SELDI-TOF mass spectrometry

Objective To screen early serum protein markers for acute myocardial infarction by SELDI-TOF mass spectrometry.Methods Twenty patients with acute myocardial infarction admitted within 2h after onset of symptoms,and 40 patients with stable angina pectoris were enrolled in this study.Serum protein profile was analyzed by surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS).The differentially expressed proteins were identified by high performance 1iquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry(LC-MS). Results Compared to stable angina pectoris,5 proteins were significantly over-expressed in acute myocardial infarction(P<0.01):1 530.32,4 301.46,8 683.44, 23 386.1,23 625.5Da.Based on differentially expressed proteins a diagnosis model for acute myocardial infarction was constructed.The sensitivity,specificity and positive predictive value of this model were 93.33%,85%and 93.33%,respectively.A-mong 5 differentially expressed proteins phosphoglycerate mutase 1 was identified,which was over-expressed in patients with early stage myocardial infarction.Conclusion Some serum proteins are over-expressed in patients with acute myocardial infarction including phosphoglycerate mutase 1.

Acute myocardial infarction SELDI-TOF-MS Biological Markers Protein Identification

2014-02-10)

(本文编辑:杨丽)

浙江省医药卫生科学研究基金计划(2007B007)

310014 杭州,浙江省人民医院干部科(张丽、谢建洪、劳迪波),检验科(郦卫星、陈莹)

张丽,E-mail:blueapplezl@163.com

猜你喜欢

质谱心绞痛心肌梗死
冠心病心绞痛应用中医辨证治疗的效果观察
以剑突下疼痛为首发症状的急性心肌梗死1例
临床医学质谱检验技术质量管理研究
气相色谱质谱联用仪在农残检测中的应用及维护
基于两种质谱技术检测蛋白酶酶切位点的方法
急性心肌梗死并发心律失常的临床特征分析
急诊PCI治疗急性心肌梗死的护理探索构架
心绞痛
老年冠心病患者警惕卧位性心绞痛
急性心肌梗死介入治疗中心律失常的有效护理干预效果观察