放射性脑损伤模型大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁标记神经干细胞MRI示踪研究

周贤斌 丁维军 于长辉 雷皓 汪洋

放射性脑损伤模型大鼠脑内移植超顺磁性氧化铁标记神经干细胞MRI示踪研究

周贤斌 丁维军 于长辉 雷皓 汪洋

目的 探讨超顺磁性氧化铁颗粒标记的神经干细胞（NSC）在放射性脑损伤大鼠模型脑内移植后，磁共振成像（MRI）示踪观察的可行性。方法 建立放射性脑损伤模型大鼠16只，4周后将磁化标记的NSC立体定向植入模型大鼠海马区。移植后1、2、4、8周行4．7T MRI干细胞示踪观察，选择T1WI、T2WI和梯度回波（GRE）序列。移植后1、8周处死大鼠，取脑组织冰冻切片后进行普鲁士蓝染色。结果 移植后MRI显示大鼠注射点处可见类圆形低信号影；GRE序列显示标记细胞较清晰，而T2WI显示大鼠脑正常结构较清晰。移植后1、8周移植部位普鲁士蓝染色可见阳性细胞，与MRI结果相符。结论 MRI能够在放射性脑损伤大鼠脑内活体连续示踪观察NSC的迁移及分布情况。

超顺磁性氧化铁 磁共振成像 干细胞 放射性脑损伤 大鼠

近年来，应用神经干细胞（NSC）移植治疗脑疾病的研究不断深入，但对于移植后神经再生的鉴定仍然以免疫组织化学方法为主，而在临床及科研工作中，需要一种无创的方法来观察NSC移植后存活、迁移及功能性分化的情况。本实验以超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米粒子作为磁性分子探针，体外标记NSC，在放射性脑损伤大鼠脑模型脑内移植后，利用高场强磁共振成像（MRI）对标记细胞进行示踪研究[1]。

1 材料和方法

1.1 实验动物NSC的分离培养 孕14～16d的SPF级SD大鼠购自浙江医学科学院实验动物中心，以1.0%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉处死后，75.0%乙醇消毒腹部皮肤，取出胚胎，解剖显微镜下取中脑腹侧约110mm×115mm×110mm组织块，将组织块反复吹打成单细胞悬液，200目滤网过滤，1 500r/min离心10min，弃上清液，加入含1.0%细胞培养添加剂N2、2.0%无血清细胞培养添加剂B27和20ng/ml人碱性成纤维生长因子（hbFGF）的DMEM/F12培养液（美国Gibco公司产品），调整细胞数后以5×106/ml接种于新的培养瓶，于37℃、5.0%CO2悬浮培养，每2～3d半量换液1次，每5～7d机械消化分离克隆传代1次。NSC的鉴定采用Nestin（美国BD Pharmingen公司产品）间接免疫荧光化学染色法[2]。

1.2 NSC的SPIO磁化标记 将SPIO（美国Advanced maganetic公司产品）和转染介质TA共孵育1h，制成SPIO-TA复合物。在NSC培养液中加入50μg/ml的Feridex（美国Advanced maganetic公司产品，内含Fe 11.2mg/ml），调节终浓度至25μg/ml，将阳离子脂质体Lipofectamine（美国Invitrogen公司产品）以1∶625体积比加入，并混合30min。将NSC上清液离心弃去，以SPIO-TA复合物重悬，在37℃、5.0%CO2条件下培养1～2h，收集NSC，500r/min离心3min，弃上清液后加入新鲜的NSC培养液。

1.3 SPIO标记NSC的普鲁士蓝染色[3]以多聚赖氨酸（50μg/ml）预先处理24孔培养板，将SPIO标记的NSC克隆球种植，7d后弃去培养液，以PBS洗涤2次，4.0%多聚甲醛固定30min，蒸馏水反复洗涤3次；Perl反应液作用30min，蒸馏水洗涤3次，1.0%核固红复染，再以蒸馏水反复冲洗，显微镜下拍照。

1.4 放射性脑损伤大鼠模型建立[4]及大鼠NSC移植 SPF级健康雌性SD大鼠16只，体重180～220g，平均（200±20）g，由浙江医学科学院实验动物中心提供（实验动物合格证号：SCXK浙2008-0033）。大鼠经3.6%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后，俯卧于西门子加速器床板（西门子KD2型），应用加速器产生的6MV-X线（剂量率200～210cGy/min），源皮距SSD 100cm，单次全脑照射，照射野3cm×2cm，光野上界位于双眼后眦连线，下界位于双耳后连线，左右露空，以1cm厚的组织补偿物覆盖照射野。铅块屏蔽双眼、颈部、胸腹部，参考深度为1.5cm，照射总剂量20Gy。

磁化标记的NSC移植至放射性脑损伤大鼠右侧海马。NSC移植前用PBS重悬，细胞浓度调整为1×107/μl。脑损伤大鼠经1.0%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于立体定向仪，移植靶点为AP：0.6mm，L：3.0mm，V：4.0mm。各靶点用微量注射器匀速缓慢注入3μl，5min内完成，留针5min后缓慢拔针，然后缝合头皮切口，回笼饲养。

1.5 MRI动态观察移植后大鼠体内SPIO标记NSC NSC移植后1、2、4、8周进行MRI动态观察。MRI检测在配备有直径为20cm梯度线圈的4.7 T BIOSPEC 47/30cm动物成像仪上完成（德国Bruker公司产品）。成像实验用直径为12cm的Helm-holtz体线圈激发，直径为2.5cm的表面线圈接收。成像条件：采用头颅线圈，窗宽（FOV）=3.5cm×3.5cm，层厚0.8mm，层间距1.6mm。分别进行T1自旋回波（SE），T2快速自旋回波（FSE），T2梯度回波（GRE）序列扫描。

1.6 移植后大鼠海马区脑组织铁染色 NSC移植后1、8周进行大鼠动脉灌注固定取大脑标本。具体步骤如下：大鼠行1.0%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔深度麻醉，开胸穿刺入升主动脉，0.9%氯化钠注射液250ml灌注，再用4.0%多聚甲醛灌注，固定约30min。切取自视交叉至其后3mm的脑组织，再以4.0%多聚甲醛固定4h。固定后PBS清洗30min，10.0%蔗糖浸泡2h，20.0%蔗糖浸泡4h，30.0%蔗糖4℃下浸泡过夜。将脑组织块置于冰冻包埋液，-20℃冰箱内冰冻，切片后行铁染色。先以免疫组织化学ABC法染色了解移植细胞在大鼠脑内的分化和存活情况；后行普鲁士蓝染色30min，倒置相差显微镜下观察。

2 结果

2.1 大鼠NSC培养与鉴定 孕14～16d的胚胎SD大鼠中脑腹侧细胞经悬浮培养3～5d后，于倒置相差显微镜下观察，部分细胞形成克隆球，见图1A。抗Nestin免疫荧光染色后于荧光显微镜下观察，间接免疫荧光化学染色阳性，见图1B。

图1 大鼠NSC培养与鉴定（A：NSC克隆球，×40；B：荧光显微镜下观察呈Nestin阳性，抗Nestin免疫荧光染色，×100）

2.2 SPIO标记的NSC脑内移植后的MRI观察[5]由于其特殊的化学结构，SPIO具有超顺磁性。SPIO分布于细胞后，使组织信号降低，在T2像上产生低信号改变。磁化NSC大鼠脑内移植后1周，行T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）扫描在移植区内可见低信号区，见图2。随着时间延长，到移植后8周T2（GRE）扫描提示移植区低信号区域逐渐有变大的趋势，移植区信号变为混杂。2.3 移植后大鼠脑组织切片普鲁士蓝染色 镜下可见，普鲁士蓝染色阳性的细胞团所在部位与MRI成像中的低信号区相一致，见图3。

图2 移植后大鼠海马区T2（GRE）扫描

图3 移植后大鼠脑组织切片中NSC铁染色（普鲁士蓝染色，×100）

3 讨论

近年来，在动物模型中应用NSC移植治疗脑创伤、缺血性脑损伤及神经退行性疾病的研究取得了显著成就。活体评价移植后NSC在脑损伤模型宿主脑内的迁移和分布已获得了突破性的进展，为NSC移植的应用奠定了坚实的基础，而在放射性脑损伤方面的应用则尚未见相关报道。

如何对移植入体内的NSC的存活、迁移、分化进行观察，一直是NSC领域研究的热点及难点问题，目前的一个研究热点是利用非侵入性纳米分子影像学技术监测、追踪细胞在体内的活动状况[6]。有研究报道利用脂质体转染SPIO标记、同时携带绿色荧光蛋白（GFP）的胚胎干细胞[7]，SPIO能够增强质子弛豫，即使在较弱的磁场中也可产生较大的磁性，而外磁场撤除后磁性也迅速消失。SPIO分布于组织后，造成局部磁场的不均匀，从而加速了质子去位相的T2弛豫。本研究证实，用SPIO标记NSC后移植，通过MRI技术可以在活体上追踪这些标记细胞的存活、迁移情况，可在移植后对NSC进行准确的组织学分布示踪。同时有研究表明SPIO对NSC的生长和增殖没有明显影响，转染了SPIO的NSC可以正常地分化为神经细胞[8]。SPIO标记非常有利于临床上NSC移植后的在体细胞示踪，通过MRI能对其在宿主体内的迁移、分布和生存情况进行实时监测。

SPIO标记的NSC植入放射性脑损伤大鼠脑内后，本研究发现在T1（SE）、T2（FSE）、T2（GRE）扫描序列中，T2（GRE）序列上出现较明显的低信号区，这表明GRE是显示SPIO标记的一种敏感扫描序列。移植后8周，T2（FSE）、T2（GRE）扫描仍可观察到移植区明显的低信号，但低信号逐渐减弱，同时在T2（GRE）成像上移植区低信号区域逐渐有变大的趋势，伴随出现高信号，移植区信号变为混杂。笔者认为，在MRI上信号逐渐减弱甚至出现高信号，是由于移植区内的细胞内铁含量下降导致。总之，通过MRI观察SPIO标记的细胞能够为移植细胞的在体检测提供了可靠的方法。

本研究表明，SPIO颗粒可以在体外标记胎鼠的NSC，利用MRI能够连续示踪观察其在放射性脑损伤大鼠脑组织内的分布和迁移情况，大鼠脑组织的体外研究证实了MRI的结果。

[1]金莉蓉,洪霞,钟春玖,等．超顺磁氧化铁标记骨髓基质干细胞移植治疗帕金森病鼠的实验研究[J]．中国临床神经科学,2006,14(4):348-353．

[2]夏鹰,江澄川,杨林,等．超顺磁氧化铁标记神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠模型的研究[J]．中华医学杂志,2006,86(17):1207-1210．

[3]Neri M,Maderna C,Cavazzin C,et al．Efficient in vitro labeling of human neural precursor cells with superparamagnetic iron oxide particles:relevance for in vivo cell tracking[J]．Stem Cells,2008, 26(2):505-516．

[4]Liu Y,Xiao S,Liu J,et al．An experimental study of acute radiation-induced cognitive dysfunction in a young rat model[J]．AJNR Am J Neuroradiol,2010,31(2):383-387．

[5]Frank J A,Miller B R,Arbab A S,et al．Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents[J]．Radiology,2003,228(2): 480-487．

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[7]Hoehn M,Küstermann E,Blunk J,et al．Monitoring of implanted stem cell migration in vivo:a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat[J]．Proc Natl Acada Sci U S A,2002,99(25):16267-16272．

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Magnetic resonance tracking of transplanted neural stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles in rats with wholebrain irradiation

Objective To explore the feasibility of labeling neural stem cells(NSCs)with superparamagnetic iron oxide (SPIO)particles in tracking the labeled cells after transplantation into rats with whole brain irradiation．Methods Irradiation injury was induced in 16 female Sprague-Dawley rats by whole brain irradiation．Four weeks after irradiation neural stem cells derived from the brain of 14-d embryonic rats and co-labeled with SPIO and poly-L-lysine were transplanted in the brain of irradiated rats．4．7T MRI scanning was performed to monitor the transplanted cells after 1,2,4,8 weeks．Two rats were sacrificed at week 1 and 8 after transplantation and Prussian blue staining on the brain sections performed．Results The areas with transplanted labeled neural stem cells were presented as hypointense zone on MR images．Prussian blue staining showed labeled cells in the transplanted hippocampus area．Conclusion MRI as a noninvasive procedure is useful for tracking the location and distribution of labeled neural stem cells in rats with whole-brain irradiation．

Superparamagnetic iron oxide Magnetic resonance imaging Stem cellRadiation brain lesions Rat

2014-09-17）

（本文编辑：胥昀）

浙江省自然科学基金项目（Y2110739）

317000 台州，温州医科大学附属台州医院消化内科（周贤斌），放疗科（丁维军、于长辉）；中国科学院波谱与原子分子物理国家重点实验室（雷皓）；复旦大学上海医学院解剖组织胚胎系（汪洋）

丁维军，E-mail：dwj1506@hotmail.com