食品中蜡样芽孢污染特点及检测方法研究进展

伊 鋆，郦 娟，董 玲，杨 永*

（武汉食品化妆品检验所，湖北武汉 430014）

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，B.c）自从1950年被Hauge氏首次报道其能引起食物中毒以来，就一直为学者们所广泛关注[1]。刘秀梅等[2]的研究表明，2005年微生物造成的食源性疾病中由B.c引起的占8.9%。王洋等[3]总结了1947～2010年有文献报道的11例B.c呕吐型死亡案例，中国有6例，可见B.c食物中毒在我国危害性很大。

鉴于B.c污染与人们日常饮食健康息息相关，且在一定条件下会造成严重危害，本文综述了几类常见食品被B.c污染的特点，并总结了国内外学者最新研究的检测及控制蜡样芽孢的手段，为有针对性地监测并控制几类食品中的污染提供参考，最大限度避免因B.c污染带来的经济损失以及健康损害。

1 易污染产品

1.1 粮食制品

由于我国的气候特点为南方温暖潮湿，北方夏秋季节室温较高，且主食为面食或米饭，又有吃隔夜米饭等生活习惯，使B.c的污染变得不容忽视。周帼萍等[4]通过研究发现，在引发呕吐型食物中毒的食品中，粮食加工品占非常大的比例，其中米饭及其制品约占81.1%，面制品约占10.1%，而在腹泻型B.c食物中毒中，粮食加工品占约30%的比例。近几年国内报道的各类粮食制品中B.c污染状况见表1。

表1 粮食制品中蜡样芽孢杆菌污染状况Table 1 Contamination conditions of B.cereus in cereal products

由表1可以看出，对米面制品进行统一抽检分析的报告结果显示，污染率基本在4%～15%，污染率相对较低；针对米粉、米线、米饭进行专项抽检的结果显示污染率相对较高，这可能与抽检样品量及代表性有关，但报告均未能指出具体的阳性样品污染浓度；在针对婴幼儿辅助食品的调查中，各份调查采样量相对充足，但检出率相差较大。

1.2 含乳制品

乳制品在加工、运输、储存等环节均易受蜡样芽孢杆菌污染，康博燕等[16]在研究酸奶生产环境中芽孢杆菌污染状况时发现，外包装车间存在蜡样芽孢污染的状况。在奶制品中的污染情况的研究较多，据报道在我国巴氏杀菌乳春季检出率超过70%[17]，冰淇淋中达60%[18]。近几年我国4类含乳制品中蜡样芽孢杆菌的污染状况见表2。

表2 含乳制品中蜡样芽孢杆菌污染状况Table 2 Contamination conditions of B.cereus in milk products

从表2可以看出，原料乳的污染率基本为20%～35%，检出量较高，均已超过103CFU/mL；乳粉的污染率在7.5%～35%，四份调查结果相差较大可能与抽检产品品牌有关，其中两份调查报告中未能提供具体检出量，从已知的报告中可以看出，乳粉中总体污染量维持在较低水平；对于巴氏杀菌乳及冰淇淋近年的抽查报告报出较少，单从引用报告结果看，两种产品检出率都很高，但污染浓度相对较低。

1.3 豆类食品

豆制品制作工艺复杂，如加工环境不卫生或在运输和存储过程中不注意控制温度容易导致豆制品被蜡样芽孢杆菌污染。在我国已经有因为豆浆[25]，豆制品（小食品）[26]被污染引起的集体中毒事件。几类常见豆制品的污染状况见表3。

表3 豆制品中蜡样芽孢杆菌污染状况Table 3 Contamination conditions of B.cereus in soybean products

由表3可以看出，发酵豆制品污染浓度相对较高。其中3份黄豆酱阳性样本污染量达到了103CFU/g；19个腐乳样品中有2个样品达到106CFU/g；有16个腐乳样品的污染量超过了103CFU/g；豆豉的调查表明虽然检出率比较高，但阳性样本的几何均数检出率均＜1 100 CFU/g。

1.4 其他类食品

除以上总结的三大类易污染产品外，国内外不断有研究报道被蜡样芽孢杆菌污染的其他产品。杨红红等[31]通过16S rDNA序列分析及构建系统发育树确定了B.c是导致桶装番茄酱胀袋的腐败菌之一。杨松等[32]对锦州市3个区超市和农贸市场的新鲜海产品、海产干品、进行芽抱杆菌污染情况调查，海产干5份检样中有4份检出，检出量达到103～105CFU/g。黄结等[33]确认有12批保健食品被检出B.c，其中螺旋藻片和钙片检出率分别为60.0%和21.1%。

2 检测方法研究进展

2.1 常规培养法

常规蜡状芽孢杆菌检测方法主要通过特异性平板甘露醇卵黄多粘菌素琼脂选择性分离，这种方法灵敏度高，专一性较强，但在区分蕈状芽孢杆菌时，需要在营养琼脂上培养数天观察根状生长状况，检验周期较长。KIM D H等[34]研制的新型蜡样芽孢计数培养基以马血为基础，加入卵黄、多粘菌素B等成分，与MYP相比，可以在样品中背景菌较多的情况下很好地突出目标菌；卢勉飞等[35]研制的B.c显色培养基HKMCB选择的是具有高特异性的磷脂酶，与MYP相比可以直接从菌落颜色区分蕈状芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。

2.2 核酸分析方法

近年来，学者们围绕与蜡状芽孢杆菌致病相关的4个基因hbl、nhe、cytK和ces采用PCR法实现了对B.c毒株的快速检验。PCR方法在高通量检测及鉴定致病菌方面具有明显的优势，表4列出了近几年具有代表性的研究成果。其中，THAPA S P等[39]以cytK为靶基因，采用多重PCR方法，实现了同时检测包括蜡样芽孢杆菌在内的5中食源性致病菌的目标。CREMONESI P等[43]采用实时定量PCR方法以ces为靶基因，更实现了同时检测包括蜡样芽孢杆菌内的23中常见食源性致病菌。KIM J M等[37，41]则从区分致病及非致病性入手，分别采用mPCR和qPCR方法实现了蜡样芽孢杆菌的快速检测。ZHANG Z H等[38]将核酸交联染料技术与多重PCR方法相结合，在满足区分致病及非致病性蜡样芽孢的前提下，消除了死菌DNA扩增信号对PCR扩增的影响，实现了对蜡样芽孢活菌的检测。MARTÍNEZ-BLANCH JF等[42]利用RT-qPCR方法检测蜡样芽孢磷酯酰胆碱特异性磷酯酶mRNA，实现了对活菌的定量检验，在人工污染的样品中检出限可以达到1.1×104CFU/mL。

此外，为了缩短检验周期，周巍等[44]采用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法，将酸乳经前增菌后提取DNA进行分析，此方法特异性良好，以苏云金芽孢杆菌DNA扩增也并无条带出现，检出限为6.4 CFU/mL，人工污染的检出限可以达到21 CFU/mL，实现了缩短了检测时间的目的。

表4 mPCR和qPCR方法检测蜡样芽孢杆菌常用引物Table 4 Common used primers for detection of B.cereus by mPCR and qPCR

2.3 现代仪器分析方法

随着仪器制造业及信息技术的飞速发展，光谱、色谱、质谱以及各类生物传感器都开始在微生物鉴定方面有所应用。万佳蓉等[45]采用傅里叶变换红外光谱非破坏性地分析B.c，结果表明，根据二阶导数光谱特征吸收峰可区分B.c细胞的荚膜、芽孢、贮能物质等特殊结果物质。郑秋月等[46]利用变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）区分蜡样芽孢杆菌不同长度DNA片段产生的特异峰形分析其gyrB基因，数百个样本分析可以在一天完成。在FERNÁNDEZ-NO I C等[47]采用微生物的鉴定领域今年发展起来的新型分析测试手段MALDI-TOF MS方法对收集到的57株芽孢杆菌进行分型，结果表明该方法可以有效区分芽孢杆菌，尤其可以很好地将B.c与解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌区分开。KANG X B等[48]采用壳聚糖作为交联剂制作的双层纳米金电化学免疫传感器检测蜡样芽孢的检出限可以达到10.0 CFU/mL，灵敏度在5.0×101～5.0×104CFU/mL（R=0.996 6）范围内。喻勇新等[49]采用金属氧化物气敏传感器检测了TSB培养液中的挥发性代谢产物，可以鉴别出B.c、单增李斯特菌、缓慢葡萄球菌。

3 结语

目前国际上许多国家都已经将B.c检测纳入乳制品检验监测项目，但我国还没有把蜡样芽孢及其毒素作为一种常规监测项目来对待。尽管B.c腹泻型食物中毒不会造成致死性伤害，但是呕吐型食物中毒带来的死亡事件不应该被忽视。在研究食品中蜡样芽孢杆菌污染状况时还存在一些问题。

首先，在监测过程中应扩大采样量及产品类别，且监测的结果分析中应更多关注具体污染浓度，辅助毒力基因分析结果，以全面了解蜡样芽孢的污染状况。在避免源头污染的同时，尤其应关注散装的、保质期时间长的、适于低温保存的、真空包装产品的污染状况。有些调查研究在4年甚至4年后才整理出版，缺乏实效性，急需构建全国范围内的网络平台，及时公布调查研究结果，为以后监测方向提供参考。其次，各类新的快速检测技术在实际样品检测中还存在检出限较高的问题，且实验人工污染样品主要为乳制品，种类单一很难普及应用到所有食品检验中。开发快速、准确、高通量且能区分活菌的检测方法仍然是今后的热点研究方向。最后，今后在蜡样芽孢杆菌污染的检测方向方面是否需要监测其毒素产生状况及监测毒力基因携带情况，或者监测方向是否应该监测蜡样芽孢杆菌族在食品中污染状况，才能更有效地避免给商家带来经济损失，减少给人们身体健康带来损害，是很值得监管部门深思的问题。

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