南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物S9片段ORF序列分析

凌晓曦， 刘 勇，， 张松柏， 匡 炜， 彭 静， 周灏明， 张德咏，*

（1.湖南农业大学植物保护学院，长沙410128；2.湖南省植物保护研究所，长沙 410125）

南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物S9片段ORF序列分析

凌晓曦1， 刘 勇1，2， 张松柏2， 匡 炜2， 彭 静2， 周灏明2， 张德咏1，2*

（1.湖南农业大学植物保护学院，长沙410128；2.湖南省植物保护研究所，长沙 410125）

摘要本文克隆了湖南省2011－2013年水稻的15个SRBSDV分离物S9两个基因，并测定了其核苷酸序列，序列分析与比较表明，S9两个ORF序列同源性均大于99.5%。突变位点分析表明，S9编码的两个ORF有3～9个突变位点，但大部分的核酸突变为无义突变。系统发育分析表明，S9编码的两个ORF高度同源，处于相同的的系统发育分支。

关键词南方水稻黑条矮缩病； ORF； S9片段； 序列分析

南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice blackstreaked d warf virus，SRBSDV）于2001年在广东省阳西县首次发现［1］，2008年被正式鉴定为呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）第2组的一个新种［2-3］。2009年，该病在广东、海南、江西和湖南等省的部分稻区暴发，据不完全统计，造成约6 500 hm2水稻失收，受害面积达30万hm2［4］。

SRBSDV的基因组由10条双链RNA（dsRNA）组成，根据电泳迁移速率从慢到快依次命名为S1～S10。由于SRBSDV是2008年后才被人们熟知和广泛关注的新病毒，因此对其编码蛋白的功能研究甚少。根据SRBSDV与RBSDV同属于斐济病毒属且编码蛋白的高度同源性，可以推测SRBSDV编码6个结构蛋白（P1、P2、P3、P4、P8、P10）和7个非结构蛋白（P5-1、P5-2、P6、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2）；推测结构蛋白P1为病毒RNA依赖的RNA聚合酶，P2为病毒内核的组分，P3为帽子酶，P4为病毒外壳的B刺突蛋白，P8为病毒的核心衣壳蛋白，P10为病毒主要外层衣壳蛋白，其序列具有保守性，是分类和鉴定病毒属种的重要依据［5-9］。目前已有的研究主要针对SRBSDV编码非结构蛋白的功能。最新研究推测表明P5-1、P6蛋白与病毒原质的形成有关，P7-1蛋白可能参与病毒的扩散［10］。

病毒、寄主以及传毒介体长期的互作过程中，均会发生相应的适应性改变，大量研究表明，病毒、寄主和传播介体，在相互作用过程中存在协同进化［11］。SRBSDV的S9编码的非结构蛋白是提供病毒复制和装配场所病毒原质（viroplasm）的组分之一［9］，在SRBSDV的增殖过程中发挥重要功能。这些基因的进化，将影响SRBSDV的复制，从而影响该病毒的侵染性及寄主适应性，在SRBSDV遗传多样性的研究中，已有S10的报道［12-13］。但目前鲜见SRBSDV的S9编码基因的遗传多样性研究报道。

本文克隆了2011－2013年湖南省不同地区侵染水稻的SRBSDV的基因组组分9（S9）的两个ORF，分析了其突变和遗传多样性，为该病害的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 水稻样品

从湖南省主要水稻产区采集样品，－20℃保存。

1.2 总RNA的提取及RT-PCR

水稻总RNA抽提采用TRIzol法，SRBSDV的RT-PCR检测方法见参考文献［2］，检测引物为S10-F：5′-CGCGTCATCTCAAAACTACAG-3′，S10-R：5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′，扩增片段大小约为700 bp。

1.3 S9的ORF序列克隆与分析

根据GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／）中SRBSDV S9全序列（EU523359），设计2对引物（表1），扩增目标片段包含SRBSDV S9的两个ORF及间隔区（图1）大小分别为1 078 bp和1 272 bp。

图1 序列克隆引物Fig.1 Primers for cloning the sequences

表1 S9 ORFs克隆引物Table 1 The primers of cloning S9 ORFs of SRBSDV

序列测定委托上海生工生物工程技术服务有限公司，序列的同源性比较及系统发育分析，利用生物信息学软件Mega 4［14］。

2 结果与分析

2.1 SRBSDV检测及S9部分序列克隆

湖南省采集的50个水稻样品中，RT-PCR检测结果表明，共有15个阳性样品（表2）。以SRBSDV阳性水稻样品总RNA为模板，以设计的2对特异性引物，进行RT-PCR扩增，扩增片段采用琼脂糖凝胶电泳，检测结果表明，设计的两对引物均能扩增出与预期大小一致的单一目的条带。切胶回收扩增产物，链接到T载体上，转入大肠杆菌，序列测定委托上海生工生物工程技术服务有限公司。测定的序列登录NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／），登录号见表2。

表2 SRBSDV阳性样品信息表Table 2 Sequenced rice samples infected by SRBSDV

续表2 Table2（Continued）

2.2 S9ORF序列分析

2.2.1 突变位点分析

序列联配结果表明，SRBSDV的15个湖南分离物的S9两个ORF核酸序列都具有数目不一的突变位点，其中以SRBSDV-HuNyz6的突变位点最多，有9个位点发生突变。推测蛋白联配结果表明，仅有少量核酸突变位点，导致氨基酸突变。

S9ORF1的核酸序列的转换／颠换率比率为k1＝10.987（嘌呤）和k2＝19.599（嘧啶）。整体转换／颠换偏差为R＝5.454，序列变异偏好A／G或C／T的转换（表3）。S9ORF2的核酸序列的转换／颠换率比率为k1＝9.402（嘌呤）和k2＝17.041（嘧啶）。整体转换／颠换偏差为R＝4.564，序列变异偏好A／G或C／T的转换（表4）。

表3 S9ORF1碱基替换最大可能性分析Table3 Maximumcompositelikelihoodestimate ofthepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF1

表4 S9ORF2碱基替换最大可能性分析Table4 Maximumcompositelikelihoodestimateof thepatternofnucleotidesubstitutionofS9ORF2

2.2.2 核酸遗传距离分析

利用Mega4软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树（图2，图3），采用Kimura 2-参数模型（核酸序列）计算遗传距离，绘制序列系统发育树。结果表明，S9ORF1的同源性为99.54%，遗传距离平均值为0.0096±0.0038，S9ORF2的同源性为99.68%，遗传距离平均值为0.0038±0.0019。

系统发育结果表明，湖南省的15个SRBSDV分离物S9的两个ORF高度同源，处于一个进化分支（图2，图3）。

图2 SRBSDVS9ORF1系统发育树Fig.2 PhylogenetictreeofSRBSDVS9ORF1

图3 SRBSDV S9 ORF2系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of SRBSDV S9 ORF2

3 讨论

南方水稻黑条矮缩病（SRBSDV）是近年来在水稻上发现的一种新病毒，目前，该病毒的基因组序列、编码蛋白功能、与寄主互作等都有研究报道［9，15］，特别是采用高通量测序技术及生物学研究表明，SRBSDV对传毒介体［16］具有多方面的影响。这些研究工作为研究SRBSDV遗传多样性提供了基础和参考。

湖南省2011－2013年水稻的SRBSDV分离物的S9两个ORF的序列比较表明，其同源性很高（＞99.5%），大部分的核酸突变为无义突变，表明S9的两个ORF遗传稳定性高。这可能是与其编码基因的重要功能［11］相关，这两个基因的突变，将导致病毒无法复制和装配。此外，研究表明，由昆虫介体传播的植物病毒，受介体和寄主的双重选择压力，其进化受到相对较大的限制［17］。湖南省水稻的15个SRBSDV高度同源，也符合昆虫介体传播病毒同源性高的特征。

来自于湖南省不同年份不同地区的15个SRBSDV-S9高度同源，与已有文献报道的来自于我国南方不同稻区、不同年份水稻的SRBSDVS10［7，12］和SRBSDV-S7-9［2-3，7，12］同源性高的结果一致，这可能与SRBSDV的源头有关。由于SRBSDV仅由白背飞虱传播［3］，白背飞虱是迁飞性害虫［18］，因此，每年我国南方的SRBSDV最初源头都来源于白背飞虱的越冬区，因不存在地理隔离等导致的进化压力，故SRBSDV的来源单一，遗传多样性较小。

本研究结果表明，湖南省不同稻区与我国南方其他地区稻区的SRBSDV来源相同，这对生产上防治此病害具有重要的指导意义。由于毒源来源单一且为外来迁入，对于湖南SRBSDV的防控，最好的办法是在SRBSDV的毒源地进行源头防控，这需要全国范围内甚至国际间的合作。此外，针对其毒源来源单一的特点，可主抓病源侵染的关键环节，尤其是在其大量扩散时，于白背飞虱迁入高峰期全力、高效、快速防控迁入的白背飞虱成虫以切断介体的初始传毒和毒源的初始侵染，对于已迁入湖南省等地区的毒源，可考虑主抓白背飞虱迁入代若虫的防治以切断毒源的进一步扩散危害。

参考文献

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中图分类号：S 432.41

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.025

收稿日期：2013-09-26

修订日期：2014-03-01

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201003031）

*通信作者E-mail：dyzhang78＠gmail.com

Sequence analysis of ORFs of segment 9 of Junan isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus

Ling Xiaoxi1， Liu Yong1，2， Zhang Songbai2， Kuang Wei2， Peng Jing2， Zhou Haoming2， Zhang Deyong1，2
（1.College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Plant Protection Institute，Changsha 410125，China）

AbstractThe full-length sequences of two ORFs of the genome segment 9（S9）of Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）isolates collected in different regions of Hunan Province was cloned and sequenced.The homology between the two ORFs of S9 in 5 isolates was higher than 99.5%.There was 3－9 mutation sites in both ORFs，but most of them were nonsense.The results of phylogenetic analysis showed that both ORFs from different variants shared high level of sequence identity and gathered in the same cluster.

Key wordsSouthern rice black-streaked dwarf virus； ORF； segment 9； sequence analysis