六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

戴 冰， 邢 瑞， 周方亮， 肖子曾*， 黄开颜， 杨赛男， 冷 旺

（1.湖南中医药大学第一附属医院， 湖南 长沙 410007； 2.湖南中医药大学， 湖南 长沙 410007）

六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响

戴 冰1， 邢 瑞2， 周方亮2， 肖子曾2*， 黄开颜1， 杨赛男2， 冷 旺2

（1.湖南中医药大学第一附属医院， 湖南 长沙 410007； 2.湖南中医药大学， 湖南 长沙 410007）

目的 观察六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响。方法 采用高脂喂养加腹腔注射链脲佐菌素 （STZ） 的方法建立 2 型糖尿病大鼠模型。 设空白组、 模型组、 二甲双胍组、 六味地黄汤组、 六味地黄汤水提醇沉物组， 模型组和空白组给予等量生理盐水， 给药 30 d， 测各组大鼠空腹血糖值 （FBG）、 酶联免疫法 （ELLSA） 测定大鼠血清胰岛素 （INS） 水平并计算胰岛素抵抗指数 （HOMA-IR） 与胰岛素敏感性指数 （ISI）。 结果 模型大鼠 FBG≥16.7 mmol/L， 六味地黄汤及其水提醇沉物均能降低 2 型糖尿病大鼠 FBG值及 INS 水平， 降低 HOMA-IR值， 升高 ISI值。 结论 六味地黄汤可以改善 2 型糖尿病大鼠胰岛素抵抗， 其水提醇沉物可能是其改善胰岛素抵抗干预2型糖尿病的药效物质之一。

六味地黄汤；水提醇沉物；2型糖尿病；大鼠；胰岛素抵抗

随着生活水平的日渐提高， 糖尿病 （ Diabetesmellitus，DM） 已成为当今世界继肿瘤、 心脑血管病之后的第三大危害人类健康的慢性疾病［1］， 我国糖尿病患者也迅猛增加，其中 90% ～95%是 2 型糖尿病［2］。 其主要病理机制是胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能障碍。糖尿病属于中医消渴的范畴，而六味地黄方是治疗阴虚型消渴的代表方。大量临床及实验研究表明，六味地黄方可以改善2型糖尿病，但其作用机制及药效物质基础并不明确。本实验就六味地黄汤及其水提醇沉物对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响进行研究，以探讨其干预2型糖尿病的作用机制及药效物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 80 只 SPF级雄性 SD大鼠， 体质量 180 ～220 g， 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司 （许可证号：SCXK湘 2011-0003） 提供， 动物合格证号： 4304700293。

1.1.2 药物 六味地黄方配伍： 熟地黄 24 g， 山茱萸 12 g， 山药12 g， 牡丹皮9 g， 泽泻9 g， 茯苓9 g。 药材由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。

1.1.3 试剂 磷酸氢二钠 （批号为 101125）， 枸橼酸 （批号 为 100823 ）， 链 脲 佐 菌 素 （ STZ， Sigma， 批 号 为329A021， 购 自 Sigma 公 司 ）， 水 合 氯 醛 （ 批 号 为20100430）。

1.1.4 仪器 稳豪倍易型血糖仪及血糖试纸 （美国强生公司）； 旋转蒸发器 （上海亚荣生化仪器厂）； TD4-Ⅱ型台式自动平衡离心机 （长沙平凡仪表有限公司）； MK3 型酶标分析仪 （美国）。

1.2 方法

1.2.1 药物及制备［3］称取六味地黄方生药材 10 付， 共750 g， 先浸泡 30 min， 再煎 2 次， 每 次 30min， 合并药液后水浴浓缩为质量浓度 1.915 g/mL的六味地黄汤。 取适量浓缩后的六味地黄汤， 70%乙醇醇沉处理， 静置 24 h 后真空抽滤，醇溶上清液水浴浓缩，水提醇沉物最终质量浓度为 11.326 g/mL。

1.2.2 高脂饲料的制备 高脂饲料配方［4］： 普通饲料70%、 猪油 10%、 蔗糖 15%、 牛胆酸钠 0.5%、 胆固醇2.5%、 食盐 2%。 由湖南中医药大学动物部加工。

1.2.3 动物模型复制 80 只大鼠随机分为空白组 （6 只）和造模组 （74 只）， 分别用普通饲料和高脂饲料喂养 4 周后， 所有动物禁食 12 h， 造模组腹腔注射 STZ 45 mg/kg，空白组腹腔注射等体积枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液， 72 h 后检测大鼠空腹血糖 （FBG） ≥16.7 mmol/L［5］者即为 2 型糖尿病模型大鼠。

1.2.4 分组给药 造模成功的 2 型糖尿病大鼠随机分为六味地黄汤组 ［6.75 g/（kg·d）］、 六味地黄汤水提醇沉物组［6.75 g/（kg· d）］、 二甲 双胍组 ［112.5 mg/（ kg· d）］、模型组， 每组 14 只， 连续灌胃 30 d， 模型组给等体积生理盐水， 给药剂量按照 70 kg成人与 200 g大鼠体表面积折算。

1.2.5 标本 采 集 大 鼠 禁 食 10 h， 测 FBG后 腹 腔 注 射10%水合氯醛 0.35 g/kg麻醉， 解剖， 腹 主动脉取 血 ， 静置1 h后分离血清， -20 ℃冻存待检。

1.2.6 指标检测 用 ELLSA法测大鼠空腹血清胰岛素（FINS） 水平， 并计算胰岛素抗抵指数 （HOMA-IR）， 胰岛素敏感性指数 （ISI）。 HOMA-IR=FINS ×FBG/22.5， ISI= Lnl/（FBG×FINS）［6］。

1.2.7 统计学分析 采用 SPSS 16 统计软件进行正态性检验及单因素方差分析， 组间比较采用 LSD检验， 所有数据以均数 ±标准差 （） 表示。

2 结果

实验结果显示， 模型组大鼠与空白组比， FBG、 FINS、HOMA-IR明显上升， ISI明显下降 （P＜0.01） 且 FBG≥16.7 mmol/L， 表明 2 型糖尿病大鼠模型复制成功且模型稳定， 胰岛素敏感性降低，发生了胰岛素抵抗；给药各组与模型组比，大鼠 FBG、 FINS、 HOMA-IR值明显下降 （P＜0.05）， ISI值明显上升，表明二甲双胍、六味地黄汤及其水提醇沉物都能降低2型糖尿病大鼠空腹血糖，改善胰岛素抵抗，但均不能恢复到正常水平， 与空白组比， 差异显著 （P＜0.05）； 六味地黄汤及其水提醇沉物组大鼠与二甲双胍组比，差异没有统计学意义（P＞0.05）， 表明六味地黄汤及其水提醇沉物对 2 型糖尿病大鼠血糖及胰岛素抵抗的干预作用与二甲双胍没有差异；六味地黄汤水提醇沉物组与六味地黄汤组比较， FBG值与 ISI值差异有统计学意义 （P＞0.05）， 表明六味地黄汤水提醇沉物降低 2型糖尿病大鼠空腹血糖、提高胰岛素敏感性的效果，优于六味地黄汤。 见表1。

表 1 给药后各组大鼠 FBG、 FINS、 HOM A-IR、 ISI值比较

3 讨论

胰岛素抵抗 （IR） 是胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态。 IR是 2 型糖尿病的主要病机， 也是心血管疾病、血脂代谢紊乱等多种疾病的共同发病机制，是这些疾病的重要危险因素［7］。

改善 IR是治疗以上疾病的关键， 对 IR模型的研究是相关疾病的研究的基础。现用于胰岛素抵抗研究的动物模型， 多采用高脂喂养加小剂量 STZ或四氧嘧啶［8］的方法建立 2 型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型［9］， 高脂喂养采用高脂饲料［10］或高脂乳 灌 胃［11］的 方 法， STZ采 用 尾静脉注射［12］或腹腔注射的方法。因尾静脉注射操作难度较大，本研究采用高脂饲料喂养加腹腔注射 STZ的方法建立 2 型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型。然预实验中发现参照大部分文献腹腔注射 30［13］、 35［14］mg/kg STZ诱导的 2 型糖尿病大鼠成模率较低，且模型不稳定，成模大鼠血糖在一定时间内下降，本实验参照预实验结果给予大鼠腹腔注射 STZ45 mg/kg的剂量， 模型组大鼠成模后血糖 （20.39 ±2.75） mmol/L， 成模率 93%， 造模后继续高脂喂养一个月后血糖 （22.00 ± 2.76） mmol/L， 模型稳定。 但高脂饲料喂养的大鼠有拒食的现象， 体瘦明显， 给 STZ成模后体瘦虚弱， 死亡率高。我们前期用高脂乳灌胃加腹腔注射 STZ的 2 型糖尿病大鼠模型， 在给 STZ后成活率高。 所以 2 型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的最佳造模方法，高脂乳喂养加腹腔注射45 mg/kg STZ。

六味地黄是补阴剂的代表方，出自宋钱乙的 《小儿药证直诀》， 组方为熟地黄、 山茱萸、 山药、 泽泻、 牡丹皮、茯苓。主治肾阴虚证，是治疗消渴症肾阴虚型治疗的首选，现代药理及临床研究都表明其可以干预2型糖尿病。水提醇沉是提取苷类成分的常用方法，六味地黄汤水提醇沉物是其水煎液经 70%乙醇醇沉处理得到的， 其中的主要成分可能是六味地黄方的苷类成分： 芍药苷［15］、 马钱苷［16］、 莫诺苷等［17］； 本研究发现六味地黄汤及其水提醇沉物能明显降低2型糖尿病大鼠血糖、胰岛素水平，改善其胰岛素抵抗，且其水提醇沉物组降低血糖、提高胰岛素敏感性效果更优。故六味地黄汤可能是通过改善胰岛素抵抗从而干预2型糖尿病，该水提醇沉物可能是其降糖、降低胰岛素水平、改善胰岛素抵抗的药效物质基础。然后从实验大鼠的体质量数据及外表体征来看，比较给药各组大鼠体质量没有统计学意义，但水提醇沉物组大鼠体瘦、阴虚症状较为明显，健康状况并没有得到更好地改善，其原因可能是水提醇沉法会使药物中的蛋白质及多糖类等营养成分溶出，减弱了六味地黄汤改善阴虚症状的作用。

［ 1］ 杨德朝.糖尿病患者尿微量清蛋白/尿肌酐比值的临床意义［J］.检验医学与临床， 2012， 9 （1）： 125-126.

［ 2 ］ YangW， Lu J， Weng J， etal.Prevalence of Diabetes among men and women in China［ J］ .N Engl J Med， 2010， 362（12）： 1090-1101.

［3］ 戴 冰，蒋冰倩，肖子曾， 等.六味地黄汤及其水提醇沉提取物对 2 型糖尿病肾阴虚证大鼠环磷酸腺苷的影响［J］.中国生化药物杂志， 2012， 33（5）： 634-636.

［4］ 薄海美，田春雨，李继春.银耳多糖对实验性 2型糖尿病大鼠胰岛 素抵抗的影 响［ J］.时珍国医 国药， 2011， 22（8）： 1926-1927.

［5］ 张新杰，刘建坤，高冬梅，等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2 型糖尿病大鼠肾脏的保护作用［J］.中国病理生理杂志， 2012， 28（10）： 1807-1811.

［6］ 于 丹，谢海龙，齐凤琴，等.参葛降糖胶囊抗糖尿病作用的实验研究［ J］ .中医药学报， 2012， 40（3） ： 50-52.

［7］ 金智生，汝亚琴，李娟娥.红芪多糖对实验性大鼠糖尿病胰岛素抵抗瘦素的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010， 8（10）： 1215-1217.

［8］ 陈嘉斌，柴可夫，张副兴， 等.活血益气法对气滞血瘀证2 型糖尿病大鼠治疗的实验研究［J］.中华中医药学刊，2011， 29（10）： 2228-2230.

［ 9］ 徐淑云， 陈 修.药理试验方法学［M］.北京： 人民卫生出版社， 2002： 1519.

［10］ 张汝学， 贾正平， 刘景龙， 等.地黄寡糖对 2 型糖尿病大鼠肝脏糖代谢关键酶活性及基因表达的影响［J］.中草药，2012， 43（2）： 316-319.

［11］ 庞宗然， 苏晓慧， 刘祖涵， 等.菩人丹超微粉对 T2DM大血管病变大鼠主动脉形态结构的影响［J］.辽宁中医杂志，2011， 38（10）： 1923-1925.

［12］ 陈 雨， 郑少雄， 郝 杰， 等.白介素 6 在 2 型糖尿病大鼠胰岛素 抵抗中的作 用［ J］.中国 临床医学， 2011， 18（1）： 32-34.

［13］ 冯 艳.灵芝多糖对 2 型糖尿病大鼠心肌组织氧化应激的影响［ J］ .药学与临床研究， 2012， 20 （5） ： 410-413.

［14］ 付德荣， 刘承宜， 李鹏博， 等.有氧运动联合谷氨酰胺补充对 T2DM大鼠血清 GLP-1、 胰 岛素及血糖 水平的影响［J］.体育学刊， 2012， 19（6）： 132-138.

［15］ 李向阳， 屠万倩.RP-HPLC法测定六味地黄丸中丹皮酚、芍药苷和乌苏酸［J］.中成药， 2012， 34（2）： 277-282.

［16］ 段 彬， 魏玉辉.HPLC法同时测定六味地黄丸中3 种成分含量［ J］ .临床合理用药杂志， 2012， 5（11） ： 66-67.

［17］ 戴 冰， 肖子曾， 刘 磊， 等.六味地黄丸入血成分莫诺苷对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响［J］.中国临床药理学与治疗学， 2007， 12（11）： 1245-1249.

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： 1001-1528（2014）03-0608-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.036

2013-02-16

湖 南 省 自 然 科 学 基 金 项 目 （ 13JJ3096 ） ； 长 沙 市 科 技 局 项 目 （ K1106040-31 ） ； 湖 南 省 科 学 技 术 厅 科 技 计 划 项 目（2010FJ4091）； 湖南省高校创新平台开放基金项目 （11K046）

戴 冰 （1964—） ， 女， 主任药师， 教授， 主要从事中药药理学及药效物质基础研究。 Tel： 15973157636， E-mail： db0223 @163.com

*通信作 者： 肖 子 曾 （ 1959—） ， 男， 教 授， 主 要 从 事 方 剂 的 配 伍 理 论 及 药 理 作 用 研 究。 Tel： 13574801749， E-mail： xiaozz573 @126.com