乌蕨对乐果急性中毒的解毒活性研究

卢海啸， 李家洲， 郑玉华， 倪 林

（广西玉林师范学院， 广西 玉林 537000）

乌蕨对乐果急性中毒的解毒活性研究

卢海啸， 李家洲， 郑玉华， 倪 林

（广西玉林师范学院， 广西 玉林 537000）

目的 研究乌蕨对解救乐果急性中毒的活性部位。方法 采用乐果中毒小鼠模型，观察乌蕨不同提取物对乐果急性中毒的解救效果，测定乌蕨对中毒小鼠的乙酰胆碱酯酶活性的影响和存活率。结果 乌蕨水提部位组能提高小鼠的存活率； 并能显著提高乙酰胆碱酯酶的活力 (P＜0.01)。 结论 乌蕨水提部位能改善小鼠的中毒症状， 提高小鼠的存活率和乙酰胆碱酯酶的活力。

乌蕨；解毒；活性部位

乌蕨 为 鳞 始 蕨 科 Lindsaeaceae乌 蕨 属 Stenoloma 植 物，又名大叶金花草［1-2］。 乌蕨在民间有 “ 万能解毒药” 之称，广泛用于解食物和农药中毒，还用于治疮毒、毒蛇咬伤等［3-4］。 研究表明， 乌蕨水 提 物的 70%乙醇 溶 解 物可使砷中毒的小鼠死亡 率显著降低， 并能提高其 耐受性［5］。 此外，乌蕨还能防治四氯化碳肝损伤作用，并能降低血清中ALT、 MDA水平， 升高 SOD酶活性和抗氧化能力［6-8］。 据报道， 乌蕨汤能很好的治疗慢性肾衰， 疗效确切［9］。 林向东［10］用单味草药乌蕨治疗下肢顽固性溃疡 50 余例， 均取得良好疗效。关于乌蕨解救有机磷农药中毒的活性部位的研究，目前尚未有报道。本实验探讨其醇提物解救有机磷农药中毒的活性部位及其对乙酰胆碱酯酶活力的影响，为筛选新的有机磷农药解毒剂提供一定的药效学依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 昆明种小鼠， 雌雄各半， 体质量 (20 ± 4)g， 购于广西医科大学实验动物中心， 清洁级， 许可证号:SCXK桂 2009-0002。

1.2 药物及试剂 乌蕨采于广西钦州市浦北县白石水镇陈依村，经广西中医学院刘寿养教授鉴定为陵始蕨科植物乌蕨 Stenoloma chusanum(Linn.)Ching in Sinensia。 采 后 粉碎， 60℃烘干备用； 乐果乳液 (广东汕头市西陇化工厂)、阿托品溶液 (山东新华制药股份有限公司)、 碘解磷定溶液 (哈尔滨宏达动物药品厂)、 氯化乙酰胆碱 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。 所用试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 HH-s数显恒温水浴锅 (江苏省金坛市医疗仪器厂)； U1901 紫外-可见分光光度计 (北京谱析科学仪器有限公司)； RE-2000 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)； SHZ-D(Ⅲ) 循环水式真空泵 ( 巩仪市予华仪器有限责任公司)； 电子分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)等。

2 方法

2.1 乌蕨提取物的制备 称取 300 g乌蕨干草， 加入6 000 mL 65%乙醇， 加热回流1 h， 用四层纱布过滤， 得到提取液。重复提取4次，合并提取液，减压回收溶剂，得膏状提取物，即粗提物。将所得粗提物分散于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、水部分。再将各部分分别减压回收溶剂，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、水部位。

2.2 实验动物分组 将 100 只小鼠进行乙酰胆碱酯酶活性测定，计算每只小鼠的乙酰胆碱酯酶活力，剔除差异较大的， 选取60只按乙酰胆碱酯酶活力分层， 再按随机数字表分为6组 (空白对照组、 模型组、 阳性对照组、 石油醚部位组、 乙酸乙酯部位组、 水部位组)， 每组 10 只。 实验前，将所有实验用的小白鼠在实验室内饲养1周，使其熟悉实验环境，自由饮水和取食。

2.3 乌蕨不同提取部位对乐果中毒小鼠的活性筛选 实验组 (模型组、 阳性对照组、 石油醚部位组、 乙酸乙酯部位组、 水部位组) 通过灌胃给予乐果溶液 (45 mg/kg)， 空白对照组灌胃等体积的生理盐水。

上述操作结束后立即给药解救，乌蕨石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、 水部位组 (给药量均为 100 mg/kg)， 阳性对照组每只小鼠立即静脉注射按 1 mg/kg的阿托品溶液和按 75 mg/kg的碘解磷定溶液， 30 min 后， 进行尾静脉取血，备用。最后记录小鼠的死亡率。

2.4 乌蕨水提物对乐果中毒小鼠的影响 将 100 只小鼠进行乙酰胆碱酯酶活性测定，计算每只小鼠的乙酰胆碱酯酶活力， 剔除差异较大的， 选取60只按乙酰胆碱酯酶活力分层， 再按随机数字表分为6组 (空白对照组、 模型组、 阳性对照组、 水部位低剂量组 (100 mg/kg)、 水部位中剂量组 (150 mg/kg)、 水部位高剂量组 (300 mg/kg)， 每组 10只。 按表3～4分组和灌胃给药， 其中空白对照组灌胃等量的生理盐水， 按 “2.3” 项的方法进行实验， 记录小鼠的死亡率。

2.5 乙酰胆碱酯酶活力的测定 采用乙酰胆碱酯酶试剂盒进行测定。

按下式计算酶活性的绝对值:

式中:Xs——水解乙酰胆碱的活力； A——样品管的吸光度值； B——对照管的吸光度值； C——标准管的吸光度值。2.6 数据处理与统计分析 数据用 (-) 表示， 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析， 实验结果采用单因素方差分析法进行分析， 组间比较用 t检验。

3 结果与分析

3.1 小鼠的死亡率 结果如表 1、 表 2 所示， 阳性对照组和水部位组的小鼠死亡率与模型组比差别很明显。水部位的高剂量组的死亡率最低，水部位组的死亡率与阳性对照组相当。说明乌蕨的水部位具有明显的解毒作用。该部位应为乌蕨的抗乐果中毒的活性部位。且水部位组的死亡率随剂量的增大而降低。

表1 小鼠的死亡率

表2 水部位不同剂量小鼠的死亡率

3.2 试验前后小鼠血液胆碱酯酶活力的变化 结果如表3、 4所示， 给药后各组的酶活力与空白对照组相比有不同程度的提高 (P＜0.05)， 阳性对照组、 乌蕨水部位组与模型组比有统计学意义 (P＜0.01)。 故乌蕨的解毒活性部位应该为乌蕨水部位。

乌蕨水部位的不同剂量组的酶活力与阳性对照组、模型组、 空白对照组相比均有统计学意义 (P＜0.01)， 且随着剂量的增大呈现出一定的线性关系。乌蕨水部位低剂量组与阳性对照组相比无统计学意义，提示其药效强度与阳性对照组相近 (P＞0.05)。 而中高剂量组的药效强于阳性对照组 (P＜0.01)。

表3 乌蕨不同提取部位对小鼠血液胆碱酯酶活力的影响（s， n=10）

表3 乌蕨不同提取部位对小鼠血液胆碱酯酶活力的影响（s， n=10）

注: 与空 白对照组相 比，*P＜0.05，**P＜0.01； 与模型组比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 与阳性对对照组比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 与水部位组比，○P＜0.05，○○P＜0.01

组 别药物剂量/(mg·kg-1)给药前给药后空白对照组—13.59±0.2813.86±0.29●●▲▲○○模型组4513.37±1.8012.54±0.35**▲▲○○阳性对照组1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05±0.8915.43±0.19●●**石油醚部位组10014.21±0.8713.65±0.39**▲▲○○乙酸乙酯部位组10013.67±0.8112.84±0.41*▲▲○○水部位组10014.09±0.4915.27±0.36**●●

表 4 乌蕨水部位对小鼠血液胆碱酯酶活力的影响 （¯，n=10）

表 4 乌蕨水部位对小鼠血液胆碱酯酶活力的影响 （¯，n=10）

注: 与空白 对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01； 与模 型组比，●P＜0.05，●●P＜0.01； 与 阳 性 对 照 组 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别药物剂量/(mg·kg-1)给药前给药后空白对照组—13.59±0.2813.87 ±0.31●●▲▲模型组45.013.37 ±1.8012.57 ±0.39**▲▲阳性对照组1.00(阿托品)、75.0(碘解磷定)14.05 ±0.8915.48 ±0.21**●●水部位低剂量组10014.09 ±0.4915.40 ±0.30**●●水部位中剂量组15013.40 ±1.4515.81 ±0.35**●●▲水部位高剂量组30014.09±0.7615.97 ±0.56**●●▲▲

4 讨论

乐果为有机磷酸酯类农药，是难逆胆碱酯酶抑制剂。目前，有机磷酸酯类农药中毒主要是采用胆碱酯酶复活药和阿托品解救。但胆碱酯酶复活药使酶复活的效果因不同的有机磷酸酯类而异，一般来说，它对内吸磷、马拉硫磷、对硫磷中毒的疗效好，对敌百虫、敌敌畏中毒有一定的疗效，而对乐果中毒几乎无效。原因是乐果中毒所形成的磷酰化胆碱酯酶比较稳定，几乎是不可逆的，加以乐果乳剂含有苯，可能同时有苯中毒。本实验结果表明，乌蕨水部位可明显降低乐果致小鼠急性中毒的死亡率，提高血液胆碱酯酶的活力。 乌蕨水部位的低剂量 (100 mg/kg) 的药效强度与阳性对照组相当， 而中剂量 (150 mg/kg)、 高剂量(300mg/kg) 的药效强于阳性对照组。 其可能的解毒机理如下:①乌蕨水部位和乐果迅速结合，从而影响乐果的吸收，阻止乐果与乙酰胆碱酯酶的结合，防止乐果在体内形成毒性更强的氧化乐果，加速乐果在体内的消除。②乌蕨水部位和苯结合，阻止苯的吸收并加速苯在体内的消除。国内外学者对乌蕨的化学成分的研究表明，乌蕨主要含有黄酮类、 有机酸等化学成分［11-15］， 黄酮类化 合物具有明确的抗氧化能力，而乌蕨的解毒作用是否与其有关，尚不得而知。至于乌蕨水部位具体的解毒活性成分及具体的解毒机制，本课题组正在进行相关的研究中。

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R285.5

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:1001-1528(2014)02-0390-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.040

2013-02-23

玉林师范学院重点科研项目 (2011YJZD18)

卢海啸 (1974—)， 男， 讲师， 博士， 主要从事中药与天然药物活性成分及药效筛选的研究工作。 Tel:15907758504， E-mail:luhaixiao76@163.com