HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷、 汉黄芩苷、 野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素

赵 亮， 王新霞， 吕 磊， 吴文应， 朱臻宇， 柴逸峰， 张国庆*

（1.第二军医大学东方肝胆外科医院药材科， 上海 200438； 2.第二军医大学药学院， 上海 200433）

HPLC法测定清肝散结颗粒中黄芩苷、 汉黄芩苷、 野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素

赵 亮1， 王新霞1， 吕 磊1， 吴文应1， 朱臻宇2， 柴逸峰2， 张国庆1*

（1.第二军医大学东方肝胆外科医院药材科， 上海 200438； 2.第二军医大学药学院， 上海 200433）

目的 对清肝散结颗粒 (猫人参、 石见穿、 白花蛇舌草、 半枝莲及黄芩等) 中所含的黄酮类化学成分黄芩苷、汉黄芩苷、 野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素同时进行测定， 建立制剂质量控制方法。 方法 采用高效液相色谱法， Waters Xterra Rp-C18色谱柱 (3.0mm×100mm， 3.5 μm) ， 流动相为乙腈 (A) 与 0.1%甲酸水溶液 (B) ， 梯度洗脱， 体积流量 0.4mL/min， 柱温 20 ℃， 紫外检测波长为 275 nm， 进样量 5 μL， 运行时间 60min。 结果 5 个待测化合物与周围干扰峰达到基线分离， 线性范围分别为黄芩苷 4.604 ～460.4 μg/mL(r=0.999 9)； 汉黄芩苷 0.770 4 ～77.04 μg/m L(r=0.999 6)； 野黄芩苷 0.415 7 ～41.57 μg/mL(r=0.999 8)； 黄芩素 0.845 6 ～84.56 μg/mL(r=0.999 9)；汉黄芩素 0.799 2 ～79.92 μg/mL(r=0.999 7)， 日内/日间精密度均小于 3%(n=3)， 平均回收率在 97% ～102%之间 (n=6)。 清肝散结颗粒中黄芩苷、 汉黄芩苷、 野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素的含有量分别为 3.798、 0.829 9、0.180 5、 0.158 9、 0.0726 mg/g。 结论 该法简便、 快捷、 结果准确、 重复性好、 实用性强， 可用于清肝散结颗粒中的质量控制。

清肝散结颗粒；黄芩苷；汉黄芩苷；野黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素；高效液相色谱法

中药复方制剂清肝散结颗粒是东方肝胆外科医院中西医结合治疗科经长期临床实践经验总结得出的抗肝癌基本方，由猫人参、石见穿、白花蛇舌草、半枝莲及黄芩等十四味中药组成，具有清热解毒，健脾理气，化瘀软坚的作用。大量的临床观察表明，清肝散结方不仅有良好的改善患者肝功能、减轻患者症状的作用，还有良好的抑制肝癌生长，抗肿瘤转移与复发，提高患者预期生存率的作用［1］。 已有的研究结果表明清肝散结颗粒中君药猫人参、石见穿、白花蛇舌草含有三萜酸类成分［2］，而半枝莲及佐药黄芩中含有大量的黄酮类成分，主要功效为清热、解毒、散瘀、止血及利尿等， 民间主治肝炎疾病和 某些肿 瘤［3-4］； 黄 芩为唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒之功效［5-6］， 二者所含黄酮类成 分包括 黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等。文献报道黄芩苷和汉黄芩苷等黄酮类成分具有抗肿瘤、抗菌、免疫调节功能、保护心血管系统及保肝等作用［7-12］。目前， 对 黄芩 苷、 汉 黄 芩 苷、 野 黄 芩 苷、黄芩素和汉黄芩素的质量控制方法主要为高效液相色谱紫外检测法、近红外漫反射光谱法及液质联用法等［13-17］。 为了更有效 控制清 肝散结颗粒的质量，本研究采用高效液相色谱紫外检测法对该制剂中的黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素同时进行定量测定。

1 仪器与试药

Agilent1100 系列高效液相色谱仪 ( 美国， 安捷伦科技有限公司)， 包括 G1379A真空脱气机、G1311A四元泵、 G1367A自动进样器、 G1316A柱温箱和 G1315A VWD检测器； AE240 型十万分之一电 子 天 平 ( 瑞 士， 梅 特 勒-托 利 多 集 团)；SB3200-超声波清洗器 (美国， 必能信超声有限公司)； PW-超纯水系统 (香港， 力康生物医疗控股有限公司)

清肝散结颗粒委托上海市蔡同德药厂提取制备， 15g/包； 对照品黄芩苷、 汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均购自上海斯丹德生物技术有限公司 (纯度 ＞98.0%)。 乙醇为分析纯； 乙腈、甲醇为色谱纯 (美国， 霍尼韦尔国际有限公司)， 甲酸为色谱纯 (美国，希格玛科技有限公司)，水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Waters Xterra Rp-C18(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)，流动相 A相为乙腈溶液， B相为 0.1%甲酸水， 梯度洗脱 (0 ～10 min， 10% ～20%A； 10 ～30 min， 20% ～25%A；30 ～60 min，25% ～45%A)， 体 积 流 量 0.4 mL/min，柱温 20 ℃， 紫外检测波长为 275 nm， 进样量 5 μL， 运行时间为 60 min。

2.2 供试品溶液的制备 取 1 g清肝散结颗粒样品， 精密称定， 置 50 mL锥形瓶中， 加入 70%乙醇 20 mL， 超声提取 30 min， 过滤， 收集滤液；滤渣再加入 70%乙醇 20 mL， 超声 30 min， 过滤， 合并两次滤液， 定容至50 mL， 取上清液过 0.45 μm有机滤膜，取续滤液即得。

2.3 对照品贮备液的配制 精密称取黄芩苷对照品 23.02 mg置 10 m L量瓶中， 加入 70%乙醇超声使溶解， 定容至刻度， 得黄芩苷质量浓度为 2.302 mg/mL的对照品贮备液； 精密称取汉黄芩苷对照品 9.63 mg及野黄芩苷对照品 8.66 mg， 分别置25 mL量瓶中， 加入 70%乙醇超声使溶解， 定容至刻度， 即得汉黄芩苷 0.385 2 mg/mL、 野黄芩苷0.346 4 mg/mL的对照品贮备液； 精密称取黄芩素对照品 10.57 mg及汉黄芩素对照品9.99mg， 分别置 5 mL量瓶中， 加入 70%乙醇超声使溶解， 定容至刻度， 即 得 黄 芩 素 2.114 mg/mL、 汉 黄 芩 素1.998 mg/mL的对照品贮备液。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的制备 精密量取黄芩苷、 汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素单个对照品溶液各 5、 5、3、1、 1 mL，置于 25 mL量瓶， 用70%乙醇定容， 得含黄芩苷 460.4 μg/mL、 汉黄芩苷 77.04 μg/mL、 野黄芩苷 41.57 μg/mL、 黄芩素84.56 μg/mL及汉黄芩素 79.92 μg/m L的混合对照品溶液。

按逐级稀释法，精密量取上述对照品混合溶液适量， 置于 10 mL量瓶， 加 70%乙醇定容至刻度，配制系列标准对照品溶液。黄芩苷质量浓度分别为460.4、 230.2、 46.04、 23.02、 4.604 μg/mL； 汉黄芩 苷 质 量 浓 度 分 别 为 77.04、38.52、 7.704、3.852、 0.7704 μg/mL； 野黄芩苷质量浓度分别为41.57、 20.78、 4.157、 2.078、 0.4157 μg/mL； 黄芩 素 质 量 浓 度 分 别 为 84.56、 42.28、8.456、4.228、 0.8456 μg/mL； 汉黄芩素质量浓度分别为79.92、 39.96、 7.992、 3.996、 0.7992 μg/mL。

取混合对照品系列溶液， 按 “2.1” 项下色谱条件进样分析， 以质量浓度为横坐标 (x)，液相色谱峰面积为纵坐标 (y) 进行线性回归， 得回归方程， 黄芩苷 y=46.632x+141.92， r=0.999 9，线性范 围 4.604 ～460.4 μg/mL； 汉黄芩苷 y= 45.405x+28.056， r=0.999 6， 线 性 范 围0.770 4 ～77.04 μg/mL； 野黄芩苷 y=29.292x+ 2.446 4， r=0.999 8， 线性范围 0.415 7 ～41.57 μg/mL； 黄芩素 y=69.361x+14.078， r=0.999 9，线性范围 0.845 6 ～84.56 μg/mL； 汉黄芩素 y= 80.074x+47.6，r=0.999 7， 线性范围 0.799 2 ～79.92 μg/m L。

2.4.2 系统适应性 取混合对照品溶液， 按“2.1”项下色谱条件进样， 黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的色谱峰与其左右的干扰峰分离度均大于 1.5， 野黄芩苷、 黄芩苷、 汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的色谱峰的保留时间分别为 17.0、22.0、 30.8、 41.3 和 52.2 min， 理论塔板数均大于 8 000， 见图 1C。

2.4.3 专属性试验 称取 1/3 处方量的原药材(不含黄芩、 半枝莲)， 粉碎， 称取 5 g， 至 250 mL锥形瓶中， 加入 70%乙 醇 100 mL， 超声 30 min，过滤， 收集滤液， 滤渣加入 100 mL70%乙醇， 超声 30 min， 过滤， 收集滤液， 合并 2 次滤液， 取滤液过 0.45 μm有机滤膜， 按 “2.1” 项下色谱条件进样分析，所得色谱见图 1B。 5 个待测化合物保留时间处未出现干扰色谱峰，说明5种化学成分集中于组方中的黄芩和半枝莲药材，故以黄酮类成分的量为指标可以很好地控制该制剂质量。

图1 清肝散结颗粒高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Q inggan Sanjie Granules

2.4.4 精密度试验 取低、 中、 高 3 个质量浓度点混合对照品溶液， 按 “2.1”项下色谱条件进样，在1 d内分别进样3次，以及连续3 d分别进样1次，考察日内精密度和日间精密度，5个成分的日内精密度、 日间精密度均小于3%， 表明精密度良好。

2.4.5 重复性试验 取 6 份清肝散结颗粒样品约1 g， 精密称定， 按 “2.2” 项下制备供试品溶液，按 “2.1” 项下色谱条件进样分析， 计算。 结果黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素5种成分的 RSD分别为 1.57%、0.98%、2.06%、2.84%及 1.93%， 均小于 3%， 表明方法重复性良好。

2.4.6 准确度试验 取 6 份清肝散结颗粒样品0.5 g，精密称定， 置 50 mL锥形瓶中，再分别加入 含 黄 芩 苷 460.4 μg/mL、 汉 黄 芩 苷 77.04 μg/m L、 野黄 芩苷 41.57 μg/m L、 黄芩 素 84.56 μg/mL及汉黄芩素 79.92 μg/mL的对照品混合溶液 2.5 mL， 按 “2.2” 项下制备供试品溶液， 按“2.1” 项下色谱条件进样分析； 结果黄芩苷、 汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的加样回收率分别为 98.3%， 101.8%、 100.2%， 97.4%及 98.9%， RSD分别为 1.88%、2.39、 3.31%、1.27%及 3.51%； 5 种成分的加样回收率在 97%～102%之间， 符合准确度要求。

2.4.7 检测限及定量限 将黄芩苷、 汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品溶液分别进行稀释， 以信噪比为 3 ∶1确定其最低检测限， 黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的最低检 测 限 分 别 为 0.037、 0.031、 0.083、 0.034、0.016 μg/m L； 以信噪比为 10 ∶1确定其最低定量限，黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素 的 最 低 定 量 限 分 别 为 0.090 4、 0.154 1、0.166 3、 0.169 1、 0.079 9 μg/mL。

2.4.8 稳定性试验 取清肝散结颗粒样品 1 g， 精密称定， 置 50 mL锥形瓶中， 按 “2.2” 项下制备供试品溶液， 分别于 0、 3、 6、 9、 12， 24 h， 按“2.1”项下色谱条件进样分析， 黄芩苷、 汉黄芩苷、 野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素的 RSD分别为0.10%、 0.32%、0.52%、0.51%及 0.91%，5 种成分的 RSD均小于 1%， 表明样品在 24 h 内稳定性良好。

2.5 样品测定 取 3 份清肝散结颗粒样品 1 g， 精密称定， 置 50 mL锥形瓶中， 按 “2.2” 项下制备供试品溶液， 按 “2.1” 项下色谱条件进样分析。结果黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素 的 平 均 质 量 分 数 分 别 为 3.798、 0.829 9、0.180 5、 0.158 9、 0.072 6 mg/g。。

3 讨论

3.1 色谱条件

3.1.1 波长的选择 采用 DAD在 190 ～400 nm全波长扫描，结果发现黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、 黄芩素及汉黄芩素均在 275 nm处有吸收， 且共同吸收最大，同时可排除杂质对待测物的干扰，故选择275 nm为检测波长。

3.1.2 色谱柱的考察 清肝散结颗粒中成分复杂，且待测物较多，需要对所有待测化合物及干扰峰进行完全分离。考察了色谱柱的不同填料颗粒类型(Agilent SB-C18、 XDB-C18、Waters Xterra Rp-C18、Chromasil-C18及 CAPCELL PAK C18)， 不 同 内 径(4.6 mm及 3.0 mm)、 不同填料粒径 (5 μm及2.7 μm) 及不同色谱柱长 (250 mm、 150 mm及100 mm) 对 5 个待测物分离结果的影响，发现黄芩苷及汉黄芩苷很容易在各种色谱上与干扰峰得到很好的分离，但野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素与其周围的干 扰 峰 较难分离， 最后 采 用 Waters Xterra Rp-C18(3.0 mm×100 mm， 3.5 μm) 色谱柱，通过调节流动相梯度洗脱程序及温度的改变，使各待测物与周围的色谱峰实现了基线分离。

3.1.3 流动相的考察 对流动相的组成及不同比例进行了考察， 采用不同比例的甲醇-水系统、 乙腈-水系统、 甲醇-甲酸水系统 以及乙腈-甲 酸水系统，发现在流动相中加入一定比例的酸有助于提高待测物与干扰峰的分离度，经过对酸的种类、浓度的考察，得出最佳流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，并对梯度洗脱条件进行了优化，使得待测物能够与干扰峰达到基线分离。

3.2 样品提取方法 清肝散结颗粒采用超声提取方法，考察提取溶剂种类、超声时间、溶剂体积及提取次数及对颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素提取结果的影响，设计四因素三水平正交试验来进行优化。结果影响样品中含有量最高的两个成分黄芩苷及汉黄芩苷提取量的因素主次顺序为溶剂种类＞提取次数＞溶剂体积＞提取时间，而对于黄芩素及汉黄芩素，增加溶剂量及提取时间有利于提高提取率， 采用30倍量溶剂提取所得的结果与 20 倍量基本一致， 而超声 45 min比超声 30 min 提取量有所下降，综合考虑， 最终确定提取方法为 20 倍量 70%乙醇超声提取 2 次，每次 30 min。

本研究建立了高效液相色谱同时测定清肝散结颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的方法。通过对不同类型色谱柱及流动相梯度洗脱条件的摸索，确定最优色谱条件，并对方法学进行了全面考察；通过正交试验设计，考察提取溶剂种类、超声时间、溶剂体积及提取次数对清肝散结颗粒中5个黄酮类成分提取结果的影响，优化得到样品前处理条件。该方法前处理条件简便、快速，测定结果准确可靠、重复性好，实用性强，可用于清肝散结颗粒中5个黄酮类成分的定量测定，进行制剂质量控制。

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Determ ination of baicalin， wogonoside， scutellarin， baicalein and wogonin in Qinggan Sanjie Granules by HPLC

ZHAO Liang1， WANG Xin-xia1， LÜLei1， WU Wen-ying1， ZHU Zhen-yu2， CHAI Yi-feng2，ZHANG Guo-qing1*
(1.Department of Pharmacy， Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， Second Military Medical University， Shanghai200438， China； 2.School of Pharmacy， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China)

AIM To establish amethod for determining the contents of baicalin， wogonoside， scutellarin， baicalein and wogonin in Qinggan Sanjie Granules.M ETHODS HPLC-DAD was used in the analysis， the column wasWaters Xterra Rp-C18(3.0 mm×100mm， 3.5 μm) ；mobile phase was acetonitril(A)and 0.1%(V/V) formic acid in water(B)，with gradient elution.The flow rate was 0.4 mL/min， the column temperature was 20 ℃， the detection wavelength was set at275 nm， the injection volume was 5 μL， the running time was60 min. RESULTS The five compounds and the unknowns were separated with baseline， the linear range was 4.604-460.4 μg/mL(r=0.999 9)for baicalin； 0.770 4-77.04 μg/mL(r=0.999 6)for wogonoside， 0.415 7-41.57 μg/mL(r=0.999 8)for scutellarin， 0.845 6-84.56 μg/mL(r=0.999 9)for baicalein， 0.799 2-79.92 μg/m L(r=0.999 7)for wogonin， respectively.The results of intra-day and inter-day precisions were both within 3%(n=3) ， and the average recovery was 97%-102%(n=6) ， the content of baicalin， wogonoside， scutellarin， baicalein and wogonin in Qinggan Sanjie Granules were 3.798， 0.829 9，0.180 5， 0.158 9，and 0.072 6 mg/g(n=3)， respectively.CONCLUSION Themethod is rapid， convenient， accurate， robust and suitable for quality control of Qingan Sanjie Granules.

Qingan Sanjie Granules； baicalin； wogonoside； scutellarin； baicalein； wogonin； HPLC

R927.2

:A

:1001-1528(2014)02-0313-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.021

2013-04-15

赵 亮 (1980—) ， 男， 主管药师。 Tel:(021)81875584， E-mail:zhaoliangphar@163.com

*通信作者: 张国庆 Tel:(021)81875571， E-mail:guoqing-zhang91@126.com