UPLC-MS法同时测定增免抑瘤颗粒中 5 种成分

龚 灿， 钱 麟， 杨 红， 齐 聪*， 王长虹

（1.中药标准化教育部重点实验室， 中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室， 上海市复方中药重点实验室，上海中医药大学中药研究所，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院妇科， 上海 201210）

UPLC-MS法同时测定增免抑瘤颗粒中 5 种成分

龚 灿1，2， 钱 麟2， 杨 红2， 齐 聪2*， 王长虹1*

（1.中药标准化教育部重点实验室， 中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室， 上海市复方中药重点实验室，上海中医药大学中药研究所，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院妇科， 上海 201210）

目的 建立同时测定增免抑瘤颗粒 (黄芪、党参、白芍等) 中芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷和汉黄芩素的 UPLC-MS 方法。 方法 采用 Waters公司 UPLC-Micro 2000 仪器 ESI+离子模式下选择离子监控， 以柳胺酚为内标； 色谱分离采用 Acquity UPLC BEH C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm， 1.7 μm) ； 流动相为 0.1%甲酸水溶液 ( 含 5 mmol/L的乙酸铵)(A)-乙腈 (B)， 梯度洗脱； 体积流量 0.3 mL/min； 柱温 30 ℃。 结果 芍药苷、 芍药内酯苷、 黄芪甲苷、 野黄芩苷、 汉黄芩素分别在 12.63 ～1 616 ng/mL(r=0.999 8)， 12.44 ～1 592 ng/mL(r=0.999 9)， 12.53 ～1 604 ng/mL(r=0.999 4)， 12.94 ～160 6 ng/mL(r=0.999 7)， 2.5 ～160 ng/mL(r=0.999 8) 范围内线性关系良好。 平均回收率分别为 101.6%(RSD为 2.40%)， 98.84%(RSD为 2.75%)， 97.89%(RSD为 1.49%)， 98.34% (RSD为 2.03%) 和 97.13%(RSD为 1.73%)。 结论 所建立 UPLC-MS 方法简捷、 准确、 重复性好， 可用于增免抑瘤颗粒剂的质量控制。

增免抑瘤颗粒； UPLC-MS； 芍药苷； 芍药内酯苷； 黄芪甲苷； 野黄芩苷； 汉黄芩素

增免抑瘤颗粒是在已故名中医庞泮池教授治疗卵巢癌经验方的基础上制备而成，具有益气活血、清热养阴等功效，由黄芪、党参、生地、鹿角霜、白芍等十一味药材组成。 临床应用20余年疗效显著［1-2］。临床研究证实， 该方在增效 减毒方 面具有良好的作用，尤其在卵巢癌患者生存质量的提高、化疗疗程的完成率、预后的改善方面都有显著的疗效［3-4］。

前期药效学实验表明增免抑瘤颗粒能抑制肿瘤血管新生［5］。 增免抑瘤颗粒辅助化疗可逆转耐药卵巢癌裸鼠对顺铂的耐药性，增强其抑瘤作用［6-7］。 可提高荷瘤小鼠脾脏指 数， 提高荷 瘤小鼠外周血中白细胞数［1］。临床应用和药效实验研究证实了增免抑瘤方的增效减毒作用，但目前对增免抑瘤方中成分定量测定和质量控制的研究较少。因此， 本实验选择芍药苷 (paeoniflorin)、 芍药内酯苷 (albiflorin)、 黄芪甲 苷 (astragalosideⅣ)、野黄芩苷 (scutellarin)、 汉 黄芩素 (wogonin) 为检测对象， 经过对检测条件的摸索与优化， 建立 UPLC-MS 法同时测定增免抑瘤颗粒中芍药苷、 芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷和汉黄芩素5种成分，为更好地控制该复方制剂质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Acquity Ultra Performance LCTMMicromass ZQ2000 液质联用仪 (Waters Corp.，Milford， MA， USA)， 配备电喷雾离子源，单四级杆质谱检测器， MassLynxTM4.1 数据分析软件； Acquity UPLC BEH C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm， 1.7 μm，Waters， USA)； BT-25S 电子分析天平 ( 北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250DB数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试 药 芍 药 苷 对 照 品 ( 批 号 110736-201136)、 野 黄 芩 苷 对 照 品( 批 号 110842-201106)、 汉 黄 芩 素 对 照 品( 批 号 111514-200403)、 柳胺酚对照品 (批号 20100609) 均购于中国药品生物制品检定所，芍药内酯苷对照品(纯度 ＞99%)、党参炔苷对照品 (纯度 ＞98%)、黄芪甲苷对照品 (纯度 ＞99%) 均购自上海永恒医药科技有限公司。增免抑瘤颗粒由上海中医药大学附属曙光医 院 药 剂科提供 (10g/袋， 批 号 为20120301、 20120302、20120303)。 乙腈、甲酸为色谱纯， 去离子水 (18.2 MΩ) 由 Milli-Q纯水仪(Millipore， Bedford，MA， USA) 制备。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm， 1.7 μm)； 流动相为 0.1%甲酸水溶 液 ( 含 5 mmol/L的 乙 酸 铵)(A)-乙 腈(B)， 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1；体 积 流 量 0.3 mL/min；柱温 30 ℃； 进样量 5 μL； 0.5 min 之前和 8.5 min 之后流动相切入 waste状态。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution p rogram

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾电离源正离子模式(ESI+)； 选择离子反应监测 (SIR) 模式； 毛细管电压3.00 kV； 锥孔电压20 V； 提取电压 1 V； RF透镜电压 0.5 V； 离子源温度 120 ℃； 去溶剂温度350 ℃； 脱溶剂气流量 500 h/Lr， 锥孔反吹气流量75 h/Lr。

芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素、党参炔苷和内标柳胺酚的检测模式、检测离子、 准分子离子峰质荷比和保留时间见表2。

结果表明，供试品图谱中在与芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素对照品图谱相同的保留时间处有色谱峰，与党参炔苷对照品色谱相同的保留时间处没有色谱峰，与其他组分能达到基线分离。对照品及样品典型色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素、内标柳胺酚对照品 4.04、 3.98、 4.01、 4.14、 4.00、10.13 mg， 置 10 mL量瓶中， 加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取上述的对照品溶液适量，用甲醇-水 (1 ∶1) 稀释， 分别得到质量浓度为 20 μg/m L的芍药苷、 芍药内酯苷、 黄芪甲苷、 野黄芩苷及 1 μg/m L的汉黄芩素对照品溶液贮备液。 同时用甲醇-水 (1 ∶1) 混合溶液制备质量浓度为 1 μg/mL的内标柳胺酚对照贮备液备用。

表2 各化合物的检测模式、 检测离子、 准分子离子峰质荷比、保留时间Tab.2 Ionization mode， m onitoring ion， m/z and retention times of seven constituents

图 1 对照 品 （ A） 和 样 品 （ B） 的 UPLC-M S SIR图谱Fig.1 UPLC-MS SIR chromatograms of m ixed reference substances（A） and sam p les（B）

2.2.2 增免抑瘤颗粒制备 取处方中的黄芪药材加 6 倍量 60%乙醇回流提取 3 次， 1.5 h/次。 药渣挥干乙醇后并入其余十味药材 (党参、生地、半枝莲、白术、天冬、枸杞、鹿角霜、八月札、木香、 白芍) 中加 8 倍量水回流提取 3 次， 1 h/次。水提液减压浓缩至密度为 1.1 ～1.2(60 ℃)， 加乙醇至体积分数为 70%进行醇沉， 静置过滤， 滤液与黄芪醇提液合并， 减压浓缩至密度为 1.1 ～1.2(60 ℃)，加入 1/3 处方量的糊精， 喷雾干燥。所得浸膏粉加入剩余处方量的糊精，混合均匀，干法制粒，整粒，检验合格后装入复合铝塑袋中，即得成品。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取增免抑瘤颗粒 0.5 g， 置具塞锥形瓶中， 精密加入稀乙醇 (529→1000， 下同)50 m L， 密塞， 称定质量， 超声提取 60 min， 放冷， 用稀乙醇补足失质量， 摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过， 即得续滤液。 由于续滤液中各成分含有量相差很大，因此将其分别进行稀释， 用于不同成分的测定。 精密量取该续滤液 2.5 mL， 置5 mL量瓶中， 加入 1 μg/mL的内标柳胺酚对照品溶液 0.2 mL， 加甲醇-水 (1 ∶1) 稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液，用于黄芪甲苷、野黄芪苷、 汉黄芩素的测定； 精密量取该续滤液 0.3 mL， 内标柳胺酚对照品溶液 (1 μg/mL)0.2 mL，置 5 mL量瓶中， 加甲醇-水 (1 ∶1) 稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液，用于芍药内酯苷和芍药苷的测定。

2.3 检测限与定量限 以信噪比为3 ∶1 确定检测限 (LOD)， 芍药苷为 5.05 ng/mL、 芍药内酯苷4.98 ng/m L、 黄 芪 甲 苷 5.01 ng/mL、 野 黄 芩 苷5.18 ng/m L、 汉黄芩素 12.5 ng/mL； 以信噪比为10 ∶1 确 定 定 量限 (LOQ)，芍 药 苷 为 12.63 ng/mL、 芍 药 内 酯 苷 12.44 ng/mL、黄 芪 甲 苷12.53 ng/mL、 野黄芩苷 12.94 ng/mL、 汉黄芩素2.5 ng/m L； LOQ浓度下连续进样 5 针， 计算峰面积与内标面积比值的 RSD分别为 4.18%、 4.25%、4.14%、 4.47%、3.80%。

2.4 线性关系 分别精密吸取芍药苷、 芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素对照品溶液适量， 1 μg/mL的内标柳胺酚对照品溶液 0.4 mL，分别置于 6 个 10 mL量瓶中，加甲醇-水 (1 ∶1)稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，其中芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷的系列对照品溶液质量浓度为 1 600、 800、 400、 200、100、50、 25、 12.5 ng/mL，汉黄芩素的系列对照品溶液质量浓度为 160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5 ng/mL。 按 “2.1” 项下检测条件分别进样， 记录质谱图， 以对照品峰面积与内标峰面积的比值 (Y)对对照品溶液质量浓度 (X， ng/mL) 进行线性回归，得芍药苷回归方程为 Y=0.002 2 X+0.0101 (r=0.999 8)； 得芍药内酯苷为 Y=0.007 9X-0.060 1(r=0.999 9)； 得 黄 芪 甲 苷 为 Y= 0.004 2X-0.031(r=0.999 4)； 得野黄芩苷为Y= 0.003X-0.010 1(r=0.999 7)； 得汉黄芩素为Y= 0.057 9X-0.045(r=0.999 8)；结果表明， 芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素分 别 在 12.63 ～1 616 ng/mL， 12.44 ～1 592 ng/mL， 12.53 ～1 604 ng/mL， 12.94 ～1 606 ng/mL， 2.5 ～160 ng/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取高、 中、 低 (芍药苷为 808、202、 50.5 ng/mL， 芍药内酯苷为 796、 199、 49.75 ng/mL， 黄芪甲苷为 802、 200.5、 50.12 ng/mL， 野黄芩苷为 828、 207、51.75 ng/mL，汉黄芩素为 80、20、5 ng/mL)3 种质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1” 项下检测条件同一天内连续进样 6 次， 分别测得峰面积的 RSD， 结果表明日内精密度良好。 分别连续 3 d 进样测试， 测得峰面积的 RSD， 结果表明日间精密度良好。 结果见表3。

表3 日内和日间精密度Tab.3 Precision for the analysis of five constituents（ intra-day， n=6； inter-day， n=3）

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液， 分别在 0、12、 24 h 进样， 记录图谱峰面积， 结果芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素峰面积 的 RSD 分 别 为 3.60%、2.52%、 4.62%、1.98%和 3.01%， 表 明 供 试 品 溶 液 在 24 h 内稳定。

2.7 重 复 性 试 验 取 增 免 抑 瘤 颗 粒 (批 号20120301)， 照 “2.2.2” 项下方法操作， 平行制备 6 份供试品溶液， 按 “2.1” 项下检测条件进行测定，计算，结果芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、 野黄芩苷、 汉黄芩素的 RSD分别为 4.60%、4.05%、 0.84%、 4.28%、 4.32%， 表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 称取已知含有量的增免抑瘤颗粒 (批号 20120301)9 份， 每份约 0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入不同质量浓度的对照品溶液， 各平行 3 份， 照 “2.2.2” 项下方法操作， 进样测定， 计算回收率， 结果见表4。

表4 加样回收率结果Tab.4 Results of recovery tests

2.9 样品测定 取 3 批样品， 照 “2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.1” 项下检测条件进行测定， 记录峰面积， 计算， 结果见表5。

表5 样品测定结果 （n=3）Tab.5 Contents in three batches of samples（n=3）

3 讨论

3.1 测定方法及指标成分的选择 超高效液相色谱与质谱联用法 (UPLC-MS) 具有高效、 快速、特异性强、检测灵敏度高的特点，在中药及中药复方的分析应用方面发挥了巨大作用［8-10］。在建 立分析方法初期，分别对党参炔苷、梓醇进行过考察，结果梓醇对照品在本实验检测条件下响应和峰形较差，所以未对梓醇进行测定。党参炔苷是 《中国药典》 2010 年版党参药材薄层色谱法的定性鉴别指标［11］， 本实验试图对其进行定量测定， 但在供试品中未检测到党参炔苷，说明其不适宜作为该制剂的控制指标，其原因有待于进一步研究。

3.2 质谱条件的选择 本实验比较了不同毛细管电压 (2.00、 3.00、 4.00 kV)、 锥 孔 电 压 (20、30、 40 V)、 提取电压 (1、 2 V)， RF透镜电压(0、 0.5 V) 下的对照品和样品响应值和峰形， 实验结果表明采用 3.00 kV毛细管电压、20 V锥孔电压、 1 V提取电压， 0.5 V RF透镜电压， 同时测定5种成分时的响应值和峰形优于其他条件下的测定结果。

3.3 流动相的选择 分别考察了水-甲醇、 水-乙腈、 0.1% 甲 酸 水 溶液-乙腈、 0.1% 甲 酸 水 溶 液(含 5 mmol/L的乙酸铵)-乙腈 4 种系统， 综合考虑被测物的峰形和响应值，经梯度洗脱优化，最终确定了 0.1% 甲酸水溶液 ( 含 5 mmol/L的乙酸铵)-乙腈为最佳流动相。

本实验对增免抑瘤颗粒中的特征性活性成分芍药苷、芍药内酯苷、黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素进行定量了测定。但测定结果表明，制剂中黄芪甲苷、野黄芩苷、汉黄芩素的量较低。其原因一则可能与生产用药材品质有关，一则可能与制备工艺有关，具体原因有待于进一步研究。

［1］ 张勤华，胡欣欣，齐 聪，等.增免抑瘤颗粒剂干预卵巢癌大剂量化疗后免疫及骨髓抑制的实验研究［J］.上海中医药杂志， 2011， 45(1):71-74.

［2］ 张勤华，齐 聪，王瑞杰.增免抑瘤颗粒对晚期卵巢癌患者术后化疗期生存质量的影响［J］.上海中医药杂志，2012， 46(3):41-44.

［3］ 黄宗瀚，齐 聪，张勤华.增免抑瘤合剂合并化疗对卵巢癌大鼠 bcl-2、 bax基因表达的影响［J］.上海中医药杂志，2006， 40(7):63-65.

［4］ 李久现，张勤华，胡欣欣，等.增免抑瘤方对顺铂耐药卵巢癌裸鼠耐药相 关基 因 HIF-1、 Glut1、 MDR1、 P-gp 表达的影响［J］.上海中医药杂志， 2012， 46(1):61-64.

［5］ 胡欣欣，张勤华，齐 聪，等.增免抑瘤颗粒剂抗卵巢癌荷瘤小鼠皮下移植瘤血管生成作用的实验研究［J］.中国中西医结合杂志， 2012， 32(7):970-974.

［6］ 齐 聪，张勤华，李久现，等.增免抑瘤方联合顺铂对铂类耐药卵巢癌抑瘤率影响的实验研究［J］.中国中西医结合杂志， 2012， 32(6):817-821.

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［ 8 ］ 闫广利， 方 圆， 刘树民， 等.黄芩药材 UPLC-MS 特征指纹图谱研究［ J］.中国实验方剂学杂志， 2012， 18(24): 89-93.

［ 9 ］ 耿 放， 王发善， 邹韬博， 等.五加生化胶囊 UPLC-MS 指纹图 谱 研 究 ［ J］. 药 物 分 析 杂 志， 2012， 32(7): 1171-1157.

［10］ 熊爱珍， 杨 莉， 杨雪晶， 等.UPLC-MS 同时测定千里光和欧洲千里光中阿多尼弗林碱和千里光碱的含量［J］.中国中药杂志， 2011， 36(6):702-705.

［11］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2010:264.

Simultaneous determ ination of five active constituents in Zengm ian Yiliu Granules by UPLC-MS

GONG Can1，2， QIAN Lin2， YANG Hong2， QICong2*， WANG Chang-hong1*
(1.The Ministry of Education(MOE)Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines and The SATCM Key Laboratory for New Resources and Quality Evaluation of ChineseMedicines， The Institute of Traditional Chinese Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203； 2.Department of Gynaecology， Shanghai Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201210)

AIM To establish a UPLC-MSmethod for simultaneous determining the contents of paeoniflorin，albiflorin ， astragalosideⅣ， scutellarin and wogonin in Zengmian Yiliu Granules(Astragali Radix， Codonopsis Radix， Paeoniae Radix alba， etc.).M ETHODS UPLC-MS analyses were carried out on an Acquity UPLC BEH C18column(50 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters， USA)with amixture of 0.1%formic acid aqueous containing 5mmol ammonium acetate(A)and acetonitrile(B)as themobile phase in a gradientmode.The flow ratewas0.3 m L/min and the column temperaturewasmaintained at30 ℃.RESULTS The calibration curves of paeoniflorin，albiflorin， astragalosideⅣ， scutellarin and wogonin were in good linearity over the ranges of12.63 ～1 616 ng/m L (r=0.999 8)， 12.44 ～1 592 ng/mL(r=0.999 9)， 12.53 ～1 604 ng/mL(r=0.999 4)， 12.94 ～1 606 ng/m L(r=0.999 7)， 2.5 ～160 ng/mL(r=0.999 8)， respectively， and the average recoveries were 101.6%(RSD=2.40%)， 98.84%(RSD=2.75%)， 97.89%(RSD=1.49%)， 98.34%(RSD=2.03%)， 97.13% (RSD=1.73%)， respectively.CONCLUSION Themethod is simple， feasible， and reproducible， and can be used for the quality control of Zengmian Yiliu Granules.

Zengmian Yiliu Granules； UPLC-MS； paeoniflorin； albiflorin； astragaloside Ⅳ；scutellarin； wogonin

R927.2

:A

:1001-1528(2014)02-0301-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.018

2013-04-05

上海市教委创新团队 (2009)； 国家自然科学基金 (81173291)

龚 灿 (1981—)， 女， 博士生， 研究方向: 中药活性成分与体内过程研究。

*通信作者: 齐 聪 (1957—)， 女， 教授， 博士生导师， 研究方向: 妇科肿瘤的中西医冶疗。 Tel:(021)53827407王长虹 (1964—)， 男， 教授， 博士生导师， 研究方向: 中药活性成分与体内过程研究。