UHPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中 6 种木脂素类成分及其药代动力学研究

王 青， 王 莹， 宋小妹， 张伟东， 王鹏远， 顾 宜， 王晓娟*

（1.陕西国际商贸学院， 陕西 咸阳 712046； 2.第四军医大学口腔医院药剂科， 陕西 西安 710032；3.陕西中医学院药学院， 陕西 咸阳 712046）

［制 剂］

UHPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中 6 种木脂素类成分及其药代动力学研究

王 青1， 王 莹2， 宋小妹3， 张伟东2， 王鹏远2， 顾 宜2， 王晓娟2*

（1.陕西国际商贸学院， 陕西 咸阳 712046； 2.第四军医大学口腔医院药剂科， 陕西 西安 710032；3.陕西中医学院药学院， 陕西 咸阳 712046）

目的 建立 利 用 UHPLC-MS/MS 法 同 时 测定 大 鼠 血 浆中 Gomisin D、 Gomisin E、 五味 子 醇 甲、 五 味 子 甲 素、Gomisin R和五味子乙素 6 种木脂素的分析方法， 并研究大鼠灌胃给予五味子提取物后的药代动力学特征。 方法 采用 Agilent Poroshell120 EC-C18色谱柱， 流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱， 采用电喷雾电离源 (ESI) ， 扫描方式为多反应离子监测 (MRM)。 结果 大鼠血浆中6 种木脂素成分的校正曲线线性关系良好， 日内、 日间精密度和准确度符合要求， 提取回收率 75.76% ～88.82%。 结论 该方法简便、 快速、 灵敏、 稳定， 适用于五味子提取物的体内分析，为其进一步研究奠定基础。

UHPLC-MS/MS； 大鼠血浆； 五味子； 木脂素； 药代动力学

五味子是木兰科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.)Bail1.的干燥成熟果实。习称 “ 北五味子”。其味酸、甘，性温。 有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功能，用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗盗汗，津伤口渴，短气脉虚， 内热消渴， 心悸失眠等症［1］。 五味子中含有多糖、 挥发油和木脂素 类成分［2-3］， 其中 木脂素类成分与五味子的抗肝脏损伤、抗氧化作用明显相关［4］。五味 子 中木脂素类 成 分在体内代 谢 研 究，国内外文献已有报道，主要为五味子中单一成分血药浓度测定［5-8］或 分别与 黄芩、 丹参配伍后 对其成分在大鼠体内的药代动力学影响［9-10］。 本实验 采用UHPLC-MS/MS 法同时测定五味子提取物中 6 种木脂素类成分的血药浓度，研究大鼠给予五味子提取物后的药代动力学特征，为五味子在临床上的合理应用提供理论依据［11］。

1 试药与仪器

1.1 试药 Gomisin D、Gomisin E、五味子醇甲、五味子甲素、 Gomisin R、 五味子乙素 ( 中国科学院昆明植物研究所)； 尼莫地平 (Nimodipine， 批号 100270—200002， 中国食品药品检定研究院)；乙腈、 甲醇 (色谱纯， 美国 Fisher公司)； 水为实验室自制三蒸水；其它试剂均为分析纯。五味子提取物粉末购自西安昊轩生物制品有限公司，其中Gomisin D、 Gomisin E、 五味子醇甲、 五味子甲素、Gomisin R、 五 味 子 乙 素 含 有 量 分 别 为 0.222、0.008、 9.311、 0.816、 1.466、 2.040 mg/g。

1.2 仪器 1290—6460 型三重四极杆串联质谱仪(美国 Agilent technology公司)， 配有电喷雾离子源(ESI) 及 MassHunter VersionB.04.10 工 作 软 件；Agilent1290 Infinity超 高 效 液 相 色 谱 系 统， 配 有G4220A二元泵、 G1314E VWD检 测 器、G1316C柱温箱及 G4226A自动进样器。

1.3 动 物 Sprague-Dawley大 鼠， 雄性， 体质量(300 ±20)g， 第四军医大学实验动物中心提供，动物许可证号 SCXK(军 2011025)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent Poroshell 120 ECC18(2.7 μm， 2.1 mm×100 mm)， 流动相为乙腈-0.1% 甲 酸 水 溶 液 梯 度 洗 脱， 体 积 流 量 0.4 mL/min，柱温 35 ℃， 进样量 1 μL。 梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相洗脱梯度Tab.1 Mobile phase gradients

2.2 质谱条件 采用电喷雾电离源 (ESI)； 扫描方式为多反应监测模式 (MRM) ； 喷雾气压 45 psi，雾化器温度 350 ℃； 毛细管电压正离子 4 kV， 负离子 3.5 kV；气流流量 10 L/min。扫描时间为23min。用于定量分析的离子反应及质谱参数见表2。

表2 定量离子及质谱参数Tab.2 Quantitative ionand M ass spectrum parameters

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液的配制 精密称取 Gomisin D、Gomisin E、 五味子醇甲、 五味子甲素、 五味子乙素对照品 19.5、 0.785、 27.8、 3.09、 2.06 mg， 加甲醇溶解， 并定容至10mL量瓶中， 即为对照品贮备液①； 再分别取 对 照品贮备液 ①1mL及 Gomisin R对照品1.955mg，加甲醇溶解定容至50mL量瓶中，即为对照品贮备液②。

精密移取对照品贮备液②1 mL至 10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 制成含量分别为 Gomisin D 3 900 ng/mL、 Gomisin E 157 ng/mL、 五味子醇甲5 560 ng/mL、 五味子甲素 618 ng/mL、五味子乙素412 ng/mL、 Gomisin R 39100 ng/mL的混合对照品溶液，摇匀，4℃保存备用。

2.3.2 内标溶液的配制 精密称取尼莫地平对照品适量， 用甲醇溶解定容至10 mL量瓶中， 作为内标贮备液。精密量取内标贮备液适量，用甲醇配成2.176 μg/mL的内标溶液，4 ℃保存备用。

2.3.3 五味子提取溶液配制 准确称取五味子提取物粉末 1.5 g，用生理盐水 20 mL溶解混匀， 配成 0.075 g/m L的五味子提取物溶液。

2.4 给药方案与样品采集 健康雄性 SD大鼠 5只， 给药前禁食12 h， 灌胃给予五味子提取物溶液2.0 mL/只 (相当于五味子提取物粉末 0.5 g/kg)。给药后于 0、 5、10、 15、30 min 和 1、2、 3、 4、6、 8、12、 24 h 自眼底静脉取血 0.5 mL置肝素化的 EP管中， 3 000 r/min 离心 10 min， 转移上层血浆贮存于 -20 ℃。

2.5 样品处理 精密吸取大鼠空白血浆 100 μL血浆中， 加入 10 μL尼莫地平涡旋混合 1 min， 加入100 μL甲醇涡旋混合 0.5 min， 再加入 300 μL乙腈涡旋混合 0.5 min， 12 000 r/min 离 心 10 min，取上清液 400 μL 45 ℃氮气吹干，100 μL甲醇复溶， 高速离心后1μL进样测定。

2.6 数据处理 应用 DAS 2.0 药代动力学软件求出药代动力学参数。

2.7 测定方法的建立

2.7.1 方法的专属性 空白血浆、 空白血浆加分析物标准品及给药后的血浆样品色谱图见图1。 结果显示，空白血浆在与对照品对应的保留时间处没有色谱峰，血浆内源性物质、代谢产物及其他成分均不干扰6个目标成分的检出。

2.7.2 标准曲线及检测灵敏度 精密吸取混合对照 品 溶 液0.125、 0.625、 1.25、 2.5、 5.0、10.0 mL， 分别置于 10 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 制得混合对照品系列液。取 100 μL空白血浆依次加入 10 μL内标液和 10 μL的混合对照品系列液， 涡旋混合 1 min， 按 “2.5” 项下处理， 1 μL进样测定。以目标物和内标物的峰面积比Y对目标物浓度 X用加权最小二乘法进行回归运算［12-13］。结果见表 3。 6 个成分的定量限 (LOQ) 分别为4.88、 0.21、 6.95、 0.77、 48.88、 0.52 ng/m L。

2.7.3 准确度与精密度 用空白血浆配制低、中、高3个质量浓度的质控样品各5份，测得峰面积后带入随行标准曲线计算相应的药物浓度，与理论值相比，计算方法的准确度；同一质量浓度每隔2 h测定1次，平行测定3次，计算日内精密度；每隔1 d测定 1次， 平行测定3次，计算日间精密度。结果见表 4。 日内精密度 RSD值小于 10%， 准确度在 89.71% ～98.82%之间， 日间精密度 RSD值小于 12%， 准确度在 90.58% ～98.74%之间， 均符合有关规范要求［14-15］。

2.7.4 提取回收率 用空白血浆配制低、 中、 高 3个质量浓度的质控样品各5份，按样品处理项下的方法进行处理。测得峰面积后与同浓度对照品溶液直接进样所得峰面积进行比较，计算提取回收率。结果见表5。 结果显示高中低质控样品的提取回收率在 75.76% ～88.82%之间， RSD均小于 13%。

2.7.5 样品稳定性实验 配制低、中、高 3 个质量浓度的质控样品各5 份， 贮存于 -20 ℃冰箱中，反复冻融3 次， 每次间隔24 h， 按样品处理项下的方法进行处理后进样测定，测得实际值均在理论值的 85.31% ～97.93%范围波动，RSD＜14%， 表明样品可以耐受3次冻融。低、中、高质量浓度质控样品室温放置 24 h， 在 -20 ℃冰箱中放置 30 d，测 得 实 际 值 在 理 论 值 的 85.07% ～96.65%，RSD＜12%； 样品经处理后在自动进样器中放置24 h 后， 测 定 实 际 值 在 理 论 值 的 85.05% ～96.01%， RSD＜13%， 均符合相关规定， 表明该 6种成分在血浆样品中稳定性良好。

图 1 空白血浆色谱图 （A）， 加有混合对照品 （ Gom isin D、 Gom isin E、 五味子醇甲、 五 味 子 甲素、 Gom isin R、 五 味子乙素） 和 内 标的空白血 浆 色 谱图（B）， 大鼠灌胃给药 0.5 h后的血浆色谱图 （C）Fig.1 Typical chromatograms of blank plasma （A）， spiked p lasma w ith reference subtances（Gom isin D， Gom isin、 schizandrol A、 schizandrin A、 Gom isin R、 and schizandrin B and the IS（ B） and plasma from rats at 0.5 h after administration（C）

表3 标准曲线及线性范围Tab.3 Calibration curves and dynam ic range

表 4 准确度与精密度实验结果 （n=5）Tab.4 Results of accuracy and precision（ n=5）

表 5 回收率实验结果 （n=5）Tab.5 Results of recovery tests（n=5）

2.7.6 基质效应 取 6 份不同来源的大鼠空白血浆 100 μL， 按样品处理项下的方法制得含尼莫地平内标液和低、中、高3个质量浓度的质控样品；另取流动相代替空白血浆，制得与上述标准品相同系列浓度的混合标准品溶液和内标物溶液，测得的相应峰面积比值用于评价基质效应，结果其比值均在 85.29% ～101.99%之间， 表明大鼠血浆生物基质不影响样品测定。

2.8 大鼠给药后的药代动力学 应用建立的 UHPLC-MS/MS 方法， 测定大鼠血浆药物浓度， 各时间点平均药-时曲线见图 2。 各组药代动力学参数见表 6。 由图 2、 表 6 可知， 6 种成分中 Gomisin E及五味子乙素的 t1/2明显较长， 表明此两种成分的消除较慢。

图 2 大鼠灌胃给予五味子提取物后的平均药-时曲线 （n=5）Fig.2 M ean concentration-time curve of rats after oral adm inistration of schisandra extracts（n=5）

3 讨论

本实验采用 UHPLC-MS/MS 同时测定大鼠灌服五味子提取物后血浆中6种木脂素类成分的量，以尼莫地平为内标，采用正离子模式检测。样品预处理采用了甲醇-乙腈沉淀蛋白方法， 操作简便， 血浆样品只需 100 μL， 杂质不干扰测定， 具有良好的精密度和准确度，有较高的灵敏度和专属性，重现性好，符合生物样品分析方法要求，适合大批量样品的分析测定。

实验结果显示， 6 种被测成分在 10 min 时即可检测到且达峰时间除 Gomisin D外均较短，提示这几种成分在胃部被很快吸收入血，与化合物结构差异有关；药时曲线呈现双峰，提示这6种成分在吸收过程中可能存在肠-肝循环、 肠-肠循 环或胃-肠循环。

本研究采用 UHPLC-MS/MS 系统建立了同时测定大鼠血浆样品中6种木脂素类成分特异、灵敏、可靠的定量分析方法， 该方法较 HPLC显著提高了定性分析的准确性以及定量分析的灵敏度，适于五味子的进一步药代动力学研究。

表 6 大鼠灌胃给予五味子提取物后的药动学参数 （n=5）Tab.6 Pharm acokinetics parameters of rats after oral adm inistration of schisandra extracts（n=5）

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Sim ultaneous determ ination of six lignans compounds in rat p lasm a and pharm acokinetics by UHPLC-MS/MS

WANG Qing1， WANG Ying2， SONG Xiao-mei3， ZHANGWei-dong2， WANG Peng-yuan2，GU Yi2， WANG Xiao-juan2*

(1.Shaanxi Instituteof International Tradeand Commerce， Xiangyang 712046， China； 2.Department of Pharmacy， Schoolof Stomatology， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， China； 3.School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China)

AIM To establish a UHPLC-MS/MS analyticalmethod for simultaneous determination of six lignans compounds of Gomisin D，Gomisin E， schizandrol A， schizandrin A，Gomisin R and schizandrin B in rat plasma and to study the pharmacokinetic characteristics after oral administration of Schisandra Chinensis Fructus. M ETHODS Chromatographic separation was achieved on an Agilent Poroshell 120 EC-C18column， with gradient elution using amobile phase that consisted of acetonitrile-0.1%formic acid in water.Detetion was performed by a triple-quadrupole tandem mass spectrometer inmultiple reactionmonitoring(MRM)mode using the electrospray ionization technique.RESULTS The calibration curve of six lignans compounds showed a good linear relationship， the intra-and inter-day precisions and accuracy met the requirements and the extraction recovery ranged between 75.76% ～88.82%.CONCLUSION This established method is simple， rapid，sensitive and stable and applicable to the analysis of Schisandra Chinensis Fructus for its further study.

UHPLC-MS/MS； rat plasma； Schisandra Chinensis Fructus； lignans； pharmacokinetics

R284.1

:A

:1001-1528(2014)02-0266-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.011

2013-03-15

王 青 (1987—) ， 女， 硕士， 从事中草药药效物质基础研究。 E-mail:709225603@qq.com

*通信作者: 王晓娟 (1962—) ， 女， 主任药师， 从事天然药物化学与中药新制剂研究。 E-mail:wxjyh231@fmmu.edu.cn