脊椎动物防御素的研究进展

段婷婷，李丕鹏，陆宇燕

（1.沈阳师范大学 两栖爬行动物研究所，沈阳 110034；2.沈阳师范大学 辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳 110034）

防御素（defensin）是免疫系统中重要的防御性蛋白质，由于其广谱抗微生物的特点，广泛存在于动植物体内，在早期抑制、抵御和杀灭多种外来病原微生物等方面发挥着不可取代的作用。脊椎动物的防御素依据半胱氨酸的分布和二硫键连接方式的不同，分为α－防御素、β－防御素和θ－防御素3种。主要分布于哺乳类的中性粒细胞以及人类和啮齿动物小肠潘氏细胞中的α－防御素，是1966年Zeya等在兔子和豚鼠中性粒细胞中发现的，起初称为“阳离子抗菌蛋白”，后来被命名为α－防御素［1－2］；β－防御素是Diamond［3］等1991年从牛气管粘膜上皮分离得到的，后证实在脊椎动物呼吸道、消化道及泌尿生殖道粘膜层有大量表达，是这些器官的粘膜免疫的重要组成成分，构成其先天免疫屏障；θ－防御素是Tang［4］等1999年从猕猴白细胞中分离得到的环状结构的防御素，该防御素仅在除人以外的灵长类动物体内表达。由此可见，防御素中的β－防御素分布区域最广，且均表达于机体与外界环境直接和间接相接触的位置，参与构成了机体抵御外界微生物侵袭的免疫屏障。本文就脊椎动物β－防御素的结构与功能作一总结，为相关研究人员提供便利。

1 β－防御素的蛋白结构

在β－防御素的一级结构中，氨基酸的排列顺序和组成的多样性始终是学者们关注的重点。不同物种氨基酸数量不同：人β－防御素氨基酸数量为36～65，小鼠为38～42，绵羊为35～50，鱼类为39～45［5－7］，它们的共同特点是具有8个高度保守的氨基酸残基：第1类是C末端的6个间隔不等的半胱氨酸（Cys）残基，可形成最多3个分子内二硫键，连接方式均为Cys1～Cys5，Cys2～Cys4，Cys3～Cys6。第2类是位于N末端的2个甘氨酸残基（Gly），第1个Gly位于N端第2个Cys上游相隔一个氨基酸残基的位置，第2个Gly位于第4个Cys间隔一个氨基酸残基位置处。而且，由于带正电荷的氨基酸残基大多聚集在C末端，形成了一个正电荷富集的区域，而此区域的净电荷数是防御素实现抗菌功能的必备条件［8］。借助2～3个分子内二硫键，β－防御素形成了一个整体呈“U”形空间结构，分子的顶部为C末端和N末端氨基酸残基组成的极性部分，而底部则为非极性部分。分子中主要包含3个反向平行的β－折叠片层结构、其N末端具有形成趋势的α－螺旋结构以及两种结构之间的Loop区［9］，且由Cys1～Cys5相连α－螺旋与第3条β－折叠片层，由Cys2～Cys4相连β－折叠片层1和2，由Cys3～Cys6相连β－折叠片层1和2间形成的Loop区与第3条β－折叠片层。α－螺旋和β－折叠结构均为双亲媒性，对防御素与微生物细胞膜相互作用具有很好的促进作用。另外，防御素单体还可以通过分子间非共价交联的盐桥形成二聚体，也可以通过未参与分子内二硫键的Cys残基以分子间二硫键的方式形成二聚体。二聚体的形成使疏水氨基酸残基进一步聚集，增加了分子表面电荷量，使β－防御素的结构更加稳定，且抗菌活性也得到了提升。

2 β－防御素的表达调控

人β－防御素1（HBD－1）和猪β－防御素1（PBD－1）及PBD－3在机体内的表达量基本保持稳定，不受炎性因子的诱导，故称为固有型表达。而大多数β－防御素可在放线菌、细菌、IL－lβ、TNF－α、真菌、病毒、脂多糖等物质刺激下，由病原菌及其产物与细胞中病原识别受体结合，通过细胞内信号转导机制可诱导防御素mRNA成倍的表达，故称之为诱导型的表达方式，HBD－2、HBD－3和PBD－2以及MBD－2、MBD－3、MBD－6属于此种类型的防御素。机体内β－防御素两种表达方式的结合，形成了固有型表达的防御素提供基础性防御作用，对病原菌的侵入进行快速反应和初步杀灭，诱导型表达的防御素进一步彻底清除病原微生物的互补的防御模式。而不同表达方式的β－防御素最根本的区别在于诱导型的防御素基因序列中含有NF－ΚB和AP－1的作用元件，需要炎性因子刺激后才能被诱导表达［5］。

关于β－防御素诱导的表达，研究的较为透彻的是NF－ΚB信号转导通路［10－11］：当致病微生物侵入机体时，机体相应部位细胞表面的病原模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）如Toll样受体（Toll－like receptors，TLRs）可以用其胞外区的亮氨酸重复序列识别病原体相关分子模式（pathogenassiciated molecular patterns，PAMPs）成分后，经胞内区Toll－IL－1受体结构域与骨髓分化初反应蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）结合后，再与接头分子MAL结合并激活转化生长因子β激酶1（TGF－βactivated kinase 1，TAK1），进而激活NF－ΚB诱导酶（NIK），再由NIK将IKKα／β进行磷酸化。激活后的IKKα／β可促使I－ΚB磷酸化，释放出原来与其结合的NF－ΚB的两个亚基p50和p65，NF－ΚB入核后与诱导型防御素基因序列中的作用元件相结合，启动基因转录。另外研究表明，当以CpG ODN（合成含CpG核苷酸对基序的寡核苷酸）作用于体外培养的肺腺上皮细胞A549，可以通过TLR9途径激活p38MAPK信号分子，进而激活NF－ΚB，使其释放p50和p65进入细胞核，指导HBD－2基因表达［12］；在人中耳上皮细胞株中，流感嗜血杆菌通过TLR2－MYD88－IRAK－IRA6－p38MAPK信号转导途径调控HBD－2表达［13］。这两条信号通路共同的途径是TLRs－MyD88部分。

3 β－防御素的生物活性

3.1 抗微生物活性

β－防御素具直接有杀灭细菌的功能，虽然对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有杀伤作用，但实验显示10μg／mL浓度的HBD－2对属于G－的大肠杆菌和绿脓杆菌的杀伤率可达到90%，而对属于G＋的金黄色葡萄球菌的杀伤率仅为9%［5，14－15］。这是由于两种细菌细胞膜成分的差异而导致的，带有阳离子精氨酸侧链的β－防御素易于通过静电作用与G－易于结合，而与G＋结合能力较弱，需要借助G＋细胞膜上带负电荷的磷壁酸才能与β－防御素结合［9，27－28］。因此，β－防御素对 G－的作用效果强于 G＋的作用效果。

用HBD－3处理非洲爪蟾卵母细胞后［16］，以二极电压钳记录细胞膜两侧离子电流的感应现象，并进行Detailed tail current分析，结果显示在膜两侧均可检测到KCl、NaCl、CaCl2等盐离子的存在，提示卵母细胞质膜的半透性遭损坏，导致了膜内外物质的相互流动。利用扫描电镜观察rHBD－3对早期和成熟期铜绿假单胞菌细菌生物膜（BF）的作用，发现用2倍最低抑菌浓度（MIC）的防御素处理铜绿假

3.2防御素与炎症反应

诱导型的β－防御素不仅可以由致病微生物表面物质的诱导而表达，还可以由炎性因子刺激进一步提高表达量。以恶唑酮诱导的结肠炎模型小鼠研究中发现［20］，其上皮细胞MBD－2的mRNA的表达量明显高于正常组，且两者之间呈极显著性差异；武庆平［21］发现模拟呼吸机的机械通气大鼠肺部感染铜绿假单胞菌（PA）后肺组织RBD－2mRNA和蛋白质表达量均呈先上升后下降的现象。另外，DEFB126（Humanβ－defensin 126）能引起体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7的促炎性因子IL－α，IL－1β，IL－6和TNF－αmRNA表达量下调［22］；而在细菌感染的大鼠体内，在RBD－2水平升高的同时，其肺组织中IL－1α、IL－1β等炎性因子含量有不同程度的下降，而抗炎因子IL－4、IL－10则明显升高［23］。提示β－防御素具有抑制促炎性因子和促进抗炎性细胞因子表达的作用［24］。研究显示在炎症发生早期，促炎性细胞因子可以通过Src依赖的Raf－MEK1／2－ERK1／2－MAPK信号通路途径诱导β－防御素表达上调，以参与炎症反应中对病原体的直接杀灭。当大量防御素存在的情况下，凭借其免疫激活功能可诱导未分化的T辅助淋巴细胞（Th0）向Th2类型细胞转化增多，而减少向Th1类型细胞的转化，导致Th1类型细胞分泌的促炎性因子减少，Th2类型细胞分泌的抗炎性因子增多［23］。临床发现寻常性银屑病患者皮损部位皮肤极少感染，但其HBD－2mRNA表达水平明显高于正常人皮肤的表达量［25］，从另一方面说明了防御素对促炎性因子的抑制作用。促炎性细胞因子的被抑制缓解了机体的炎性反应，同时其对防御素的诱导作用也将同步降低。随着防御素在组织间的扩散，当其浓度降至纳克水平后，防御素就丧失了杀菌活性，而其另一特殊功化活性得以发挥，通过募集白细胞进一步清除感染部位的病原体。单胞菌作用24h后BF结构变得稀疏、不规则，交联多糖复合物减少，BF内细菌存活率降低。4倍MIC组BF结构损伤程度更加明显，并且rHBD－3对BF形成和其内活菌数量均表现出强烈的抑制作用［17］。用MIC的PBD－1和PBD－2分别作用于枯草芽孢杆菌ATCC 6633和铜绿假单胞菌CMCC 10104 1h后，透射电镜观察显示：菌体细胞膜断裂，核区溶解，细胞内容物外泄，菌体空泡化［18］。因此，目前对β－防御素的抗菌机制普遍认为是：β－防御素与细菌细胞膜接触后，将其疏水部分的短肽插入靶细胞膜中，进而依靠细胞膜的电动势拉动整个分子进入质膜，形成跨膜的离子通道，改变膜的完整性和通透性，导致细胞渗透压发生变化，最终细菌不能维持自身正常的生命活动而不可逆死亡。

有研究指出二硫键对昆虫防御素（Lee KH 1998；Fázio MA 2006）抗菌功能来说是必须的因素，但对牛β－防御素2（BNBD－2）和BNBD－12的研究表明，二硫键连键模式的不同所带来的结构上的差异并没有对其活性造成影响；突变后的HBD－1分子内仅有2个二硫键，但其抗菌活性却与天然HBD－1相近；将HBD－3的3个二硫键连接方式1－5，2－4和3－6改为1－6，2－5和3－4，其抗菌活性与二硫键正常连接的HBD－3相近。因此可以认为二硫键的存在和分布状态对哺乳类β－防御素抗菌活性的影响微乎其微。

β－防御素的抗菌能力还与其自身所带正电荷数有关。HBD－1、HBD－2和HBD－3净电荷数分别为＋4、＋6和＋11，其中抗菌活性最强的是HBD－3［15］。而研究显示，HBD－3不仅单位长度下正电荷聚集程度较高，而且还拥有较长的α－螺旋片段，二者均具有促进与细菌细胞膜结合的作用［8，19］。故使得HBD－3具有较其他β－防御素更强的抗菌活性。

防御素的抗菌活性还受到环境中离子种类和浓度等因素的影响。HBD－3在50mol／L NaCl溶液中对大肠杆菌的杀菌活性可达90%左右，而在100mol／L NaCl下的杀菌活性还不到50%［19］。二价阳离子如Ca2＋、Mg2＋等能够显著抑制防御素活性，而一价阴离子如Cl－等对其活性影响不大。推测高浓度盐溶液中较多的正电荷和同样带正电荷的防御素存在着争夺与带有负电荷的细菌表面结合位点，从而导致了β－防御素与细菌胞膜的结合力变弱，抗菌活性降低。

3.3 趋化活性与免疫激活

防御素通过选择性的趋化作用，可趋使天然免疫系统中的白细胞向炎症部位集中，通过吞噬作用消灭病原微生物。HBD－1可趋化单核细胞，HBD－3和4可趋化巨噬细胞，HBD－2可趋化肥大细胞和中性粒细胞。竞争性检测实验显示，HBD－2通过与肥大细胞表面的G蛋白－磷酸酯酶C信号途径作用，完成对肥大细胞的趋化和激活作用。而HBD－2对中性粒细胞的趋化作用不仅有G蛋白－磷酸酯酶C信号途径的参与，更重要的是由趋化因子受体CCR6作为其主要的功能受体。另外，肥大细胞脱颗粒产物中的TNF－α作为促炎性因子也能增加嗜中性粒细胞聚集。

作为趋化因子的吞噬细胞炎症蛋白3（CCL20／MIP3α）是CCR6的唯一配体［5］，研究发现CCL20／MIP3α的Asp5～Asp8结构，提示了与HBD－2的Asp4～Leu9结构类似，而此结构正好是CCL20／MIP3α与CCR6特异性结合的位点β－防御素发挥趋化作用的依据［15］。而转染了CCR6的HEK细胞可以被HBD－3、MBD－2和MBD－3所趋化也为上述结论提供了佐证。对于不具有CCR6分子的巨噬细胞和单核细胞来说，β－防御素也可以通过含有多个趋化因子结合位点的CCR2分子来行使其趋化作用［26］。

抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）是机体免疫应答中的首要环节，而树突状细胞（dendritic cell，DC）、巨噬细胞和B细胞3种APC中DC的功能是最强的，其能够刺激处女型和初始型T细胞增殖，是机体免疫应答的始动者。防御素以其富集正电荷的C端作用于病原微生物致使其崩解后，与菌体碎片相连接组成“防御素－菌体碎片”复合体，随后以其N端的类似于CCL20／MIP3α的结构与树突状细胞上的CCR6分子结合［2］，促使iDC转化为mDC，并迁移至淋巴器官后激发T细胞应答［27］，启动机体抗微生物感染的获得性免疫。由于CCR6是介导天然免疫和获得性免疫的信号分子，因此这也使β－防御素成为连接先天免疫系统和获得性免疫系统的桥梁［2，26］。杨玉荣［28］等检测了雏鸡口服禽类β－防御素13（Avian beta－defensin 13，AvBD－13）后血清中IgG和IgM水平变化结果显示，AvBD－13显著提高了4～10日龄雏鸡血清内IgG和10～17日龄雏鸡血清内IgM含量，发现口服AvBD－13可以提高禽类的体液免疫，并且能够明显促进体液免疫系统反应，这也证实了防御素对获得性免疫的促进作用。

二硫键的连键模式对β－防御素趋化作用有重要意义。HBD－3的几种合成型二硫键异构体对含CCR6的HEK293细胞趋化作用的研究发现，线性类似物对两种细胞完全没有趋化活性，而其他异构体的趋化活性随细胞类型的不同而不同，含有天然二硫键的HBD－3对CCR6／HEK293细胞的趋化活性最强。此研究提示，β－防御素的趋化活性需要特定的空间构象，即能与受体结合并激活受体的空间构象。

4 展 望

细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，许多抗生素具有毒副作用，因此，发展新的动物抗感染战略势在必行。防御素由于其独特的抗菌机制，势必成为具有巨大发展潜力的新型抗菌肽药物，它的存在已经得到了各类专家学者们的极大关注，在动物保健和医学治疗方面具有广阔的应用前景。随着对防御素的深入研究，将为防御素的抗病原菌感染机制、炎性反应和免疫机制等方面提供越来越丰富的理论和实验依据，有利于开发研究出更加有效的新型疫苗和相关的药物制剂，必要时可以通过基因工程等方法进行大量生产，从而提升机体其抗病原菌的免疫性。目前对于防御素的研究仍存在一些未解决的问题，例如一些细菌病原体已经进化出抵抗机制来限制防御素杀伤作用，大部分实验还停留于动物及体外实验，临床及体内实验报道较少，但是随着科学技术手段的不断发展发展，研究一定会取得进一步突破，这对新药研发技术思路的现实意义不言而喻。

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