酵母中性脂快速检测及积累动态分析

杜秀秀 房志家 陈忠翔 匡鑫 黄志伟

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

酵母中性脂快速检测及积累动态分析

杜秀秀 房志家 陈忠翔 匡鑫 黄志伟

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

以油红O、苏丹黑B为染料，结合酸或碱热破壁萃取，建立了通过比色快速检测酵母中性脂含量的方法。其中油红O萃取效果较好，比色结果更加准确，苏丹黑B也可以作为一种替代的中性脂含量检测的染料。并用该方法初步研究了两种中性脂肪甘油三酯代谢调控的关键基因磷脂酸磷酸酶（PAH1）和甘油三酯脂酶（triglyceride lipase，TGL）敲除突变体中性脂的变化。结果显示，前者甘油三酯显著降低，但总中性脂肪含量不变，后者甘油三酯及总中性脂肪含量均明显积累；同时，用该方法监测了酵母中性脂含量随生长周期的动态变化，表明指数生长期后有明显的积累。

出芽酵母 中性脂 亲脂染料 脂肪代谢调控

微生物油脂，又称单细胞油脂（Single cell oill，SCO），能进行工业化规模开发和生产，不与食用油资源形成竞争，有着巨大的市场潜力，可能在未来生物柴油产业中发挥非常重要的作用［1，2］。其中酵母油脂的脂肪酸组成和一般植物油相近，油脂产量和生物量都比较高，产油量可达到细胞干重的70%以上，被认为是可以生产生物柴油的理想原料［2-4］。

但目前对于酵母细胞中性脂含量的检测主要是提取总类脂后通过薄层层析法［5，6］分析，而油脂提取需要使用有毒性的有机溶剂，对菌体的量要求较大，且薄层层析有时只能进行相对定量；或是通过液相色谱串联质谱法［7］定量分析，该方法对于样品的准备及仪器设备要求较高。油红O是一种高效廉价的脂溶性偶氮染料，可特异性使中性脂类物质着色，染色程度与胞内脂质含量呈正相关性，利用乙醇或异丙醇萃取吸附的染料，根据标准曲线线性回归方程可计算脂质含量［8］。该方法的可靠性已在哺乳细胞得到验证，并用于脂肪细胞分化［8，9］和脂肪沉积［10，11］等相关的研究中。酵母油脂的主要成分是甘油三酯，利用基因工程或代谢工程对酵母菌株进行改造，可提高其产油能力［12］。研究表明，酵母中甘油三酯的合成较大程度上受到PAH1编码的磷脂酸磷酸酶的调控，PAH1缺陷会导致脂肪酸代谢障碍［7，13］；而甘油三酯的水解依赖于甘油三酯脂酶TGL家族，其中主要是TGL3、TGL4，两者缺陷会形成肥胖酵母［13，14］。

本研究将油红O比色法应用到酵母中性脂的检测中，在酵母细胞中进行PAH1及TGL3、TGL4基因敲除突变体中性脂变化的初步探究和验证，并针对酵母细胞壁厚萃取困难对染色方法进行改进，旨在建立油红O染色快速特异检测酵母细胞中性脂含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 酿酒酵母BY4741、WT-vector、pah1-vector、pah1-Lipin1、tgl3/tgl4-vector本实验室保存。

1.1.2 培养基 YPD培养基［14］；酵母选择性营养缺陷培养基（SC-Ura培养基），从完全合成SC培养基［15，16］中去除尿嘧啶。

1.1.3 试剂 无水乙醇、乙醚（常熟市杨园化工有限公司），异丙醇、甲醇、乙酸（昆山晶科微电子材料有限公司），氯仿、正己烷（上海凌峰化学试剂有限公司），三油酸甘油酯（国药集团化学试剂有限公司），苏丹黑B（上海生物工程公司），油红O（沃凯化学试剂公司），甘油三酯试剂盒（上海玉兰生物技术有限公司）。

1.1.4 主要仪器 恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂；荧光显微镜，OLYMPUS；UV-2100紫外可见分光光度计，优尼科公司；ZHWY-1102C双层小容量恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；静音混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平，DENVER INSTRUMENT；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；薄层层析硅胶板HSGF-254，烟台江友硅胶开发有限公司；点样毛细管，上海欣鹏玻璃仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油红O和苏丹黑B吸收峰全波长扫描 在聚丙烯管中加入一定量的甘油三酯储液，待正己烷挥发后加入足量染色液染色。小心移去染料，用蒸馏水漂洗两次。在32℃恒温干燥的环境中挥发除去多余的水分，加入1 mL无水乙醇充分萃取吸附的油红O或苏丹黑B，在紫外可见分光光度计中进行全波长吸收峰的扫描。

1.2.2 标准曲线制作［8］将三油酸甘油酯溶解在正己烷中配成终浓度为25 mg/mL的储液，-20℃保存。取整数倍体积的储液于聚丙烯管中，待正己烷自然挥发完后加入足量的油红O工作液或苏丹黑B工作液染色2 h。小心移去染料，用蒸馏水漂洗两次去除未结合的多余染料。在32℃恒温干燥的环境中挥发除去多余的水分，加入1 mL无水乙醇充分萃取吸附的油红O或苏丹黑B，在510 nm或598 nm下测其吸光值。

油红O工作液的配制［8］：称取0.7 g油红O粉末，充分溶解于200 mL异丙醇中，室温放置过夜，不搅拌，中性滤纸常压过滤；向滤液中加入150 mL蒸馏水，4℃放置过夜，无搅拌，中性滤纸常压过滤2次。此滤液即为工作液，可室温保存6-8个月。

苏丹黑B工作液的配制［17］：称取0.3 g苏丹黑B粉末，溶于100 mL 70%（V/V）乙醇中，室温放置4-6 d，期间经常摇动，使其充分溶解后过滤，于4℃下保存备用。

1.2.3 酵母细胞中性脂的比色测定方法 取适量培养的酵母菌液，5 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗两遍，离心除去多余的水分。加入适量的油红O工作液，震荡混匀，使酵母细胞充分接触染液，混合器震荡染色2 h。5 000 r/min离心5 min除去染液，酵母细胞沉淀物用蒸馏水充分洗涤3次，去除多余的染料。离心除去多余的水分，加入200 μL 0.1 mol/L的HCl溶液，800 μL无水乙醇，震荡混匀后，沸水浴加热3-5 min，冷却后，5 000 r/min离心5 min，取萃取液于510 nm处测定其吸光值。

苏丹黑B的染色方法同油红O，染色后的酵母菌用50%乙醇（V/V）洗涤3次。离心除去多余的水分，加入200 μL 0.1 mol/L的NaOH溶液，800 μL无水乙醇，震荡混匀后室温放置30 min，沸水浴加热5-10 min，冷却后，5 000 r/min离心5 min，取萃取液于598 nm处测定其吸光值。

1.2.4 三酰甘油试剂盒检测酵母细胞内的TAG 将培养好的菌液倒入离心杯中，5 000 r/min离心10 min，用蒸馏水洗两次除去游离的甘油，将菌体转到1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min，准确称取0.2 g湿菌重的菌体。加入1 mL pH7的磷酸缓冲液，加入8 mg蜗牛酶［18］（配成40 mg/mL的母液），30℃处理1 h。将菌液转移到玻璃烧杯中，加入适量的缓冲液，用超声波细胞破碎器处理1 h，通过超声波高频振动产生的机械效应和空化效应达到破碎细胞释放油脂的目的。将细胞裂解液转移到离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清用于检测。检测步骤按照试剂盒使用说明书操作如下。

取1 mL的甘油三酯检测试剂，测定管加入10 μL待测样品；标准管加入10 μL甘油三酯标准液；空白管加入10 μL蒸馏水。混合，置于37℃水浴10 min，以空白管调零，在546 nm下以比色读取各管的吸光度值，并计算甘油三酯含量。脂。用点样器取适量溶液进行点样。先用氯仿∶丙酮∶甲醇∶乙酸：水（50∶20∶10∶10∶5）作为展层剂，展至一半取出吹干；再用己烷∶乙醚∶乙酸（80∶40∶1）作为展层剂，展至全长。待扩展剂挥发后，置于碘缸中显色并拍照。用Band Scan软件进行分析。

2 结果

2.1 油红O和苏丹黑B吸收峰全波长扫描图谱

利用紫外可见分光光度计从190-1 100 nm对油红O和苏丹黑B染色后的乙醇提取液进行波长扫描，以获得其最大吸收波长（图1）。结果显示，油红O有两个吸收峰，分别是350 nm和510 nm，其中510 nm为主吸收峰（图1-A），与查阅的文献中一致，故之后在此波长下进行比色测定吸光度值；苏丹黑B的主吸收峰在598 nm处（图1-B），故之后在此波长下进行比色。

其中，AT为测定管吸光度，AS为标准管吸光度，CS为标准品浓度。

1.2.5 油脂的提取 将培养好的菌液倒入离心杯中，5 000 r/min离心10 min，用蒸馏水洗两次，将菌体转到1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min，准确称取0.1 g湿菌重的菌体。加入1 mL pH7的磷酸缓冲液，加入4 mg蜗牛酶［7，18］（配成40 mg/mL的母液），30℃处理1 h。离心保留菌体，加入1 mL甲醇∶氯仿（2∶1，V/V），和适量的玻璃珠，涡旋振荡1 h，充分抽提油脂。离心，将上层抽提液转移到2 mL离心管中。加入500 μL 50 mmol/L的柠檬酸和500 μL的氯仿，混合后离心，取下层减压蒸去溶剂，得到总类脂，置于-20℃冰箱保存［19］。

1.2.6 薄层层析分析中性脂［20］向油脂收集管中加入30 μL的甲醇∶氯仿（2∶1，V/V），混匀溶解油

2.2 三酰甘油的油红O及苏丹黑B染色标准曲线

分别用油红O和苏丹黑B对不同含量的三油酸甘油酯进行染色，通过乙醇萃取吸附的染料，然后分别在510 nm和598 nm下测定油红O和苏丹黑B的吸光度值。以三油酸甘油酯的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制得到相应的标准曲线（图2）。甘油三酯用油红O染色后得到的标准曲线线性回归方程为y=0.0028x（R2=0.997）（图2-A），甘油三酯用苏丹黑B染色后得到标准曲线线性回归方程y=0.0111x（R2=0.9981）（图2-B）。两种染色方法得到的甘油三酯含量与吸光度值均呈显著正相关性，因此，两个线性回归方程均能用于之后中性脂含量的计算。

2.3 不同酵母突变体中性脂累积及定量测定

分别采用油红O染色法，苏丹黑B染色法，以及甘油三酯试剂盒测定甘油三酯含量与薄层层析分析酵母菌甘油三酯与麦角固醇酯的比例结合的方法，测定了WT-vector、pah1△-vector、pah1△-Lipin1、tgl3/tgl4-vector 4种菌株中性脂的含量（表1）。PAH1编码的磷脂酸磷酸酶及TGL3、TGL4编码的甘油三酯脂酶是甘油三酯代谢调控的关键基因（图3）。对酵母细胞破碎后使用甘油三酯试剂盒测定4种菌株TAG含量，结果显示，48h培养后的甘油三酯合成关键酶PAH1缺陷菌株pah1△-vector的TAG含量比野生型菌株WT-vector降低了46%；重新转入其在人类的同源基因LIPIN1的高表达质粒，菌株pah1△-Lipin1的甘油三酯含量比野生型菌株还要高一些；甘油三酯脂酶TGL3和TGL4的缺陷菌株tgl3/tgl4△-vector的甘油三酯含量明显高于野生型菌株。提取4种菌株总类脂后，薄层层析分析了样品中甘油三酯与甾醇酯的比例，进而计算出每种菌株总中性脂的含量。pah1△-vector菌株尽管甘油三酯含量明显减少，但其甾醇酯比例高，故总中性脂水平没有改变。而pah1△-Lipin1和tgl3/tgl4△-vector菌株的总中性脂含量均较野生型菌株明显提高。利用油红O染色后，在酸热作用下乙醇萃取吸附的染料，萃取效果极佳，于510 nm处比色法测得的4种菌株中性脂含量与用上面方法得出的结果具有较高的一致性。由于酵母细胞壁较厚，直接萃取效果较差，利用酸热法破碎细胞壁能显著提高萃取效果，使测定结果更加准确，故改进后的方法可用于检测酵母菌中性脂含量。苏丹黑B染色后，对细胞着色较深，萃取更加困难，虽然延长了萃取时间及碱热处理时间，萃取效果仍没有油红O好，因此其比色结果反而比油红O比色法更低一些，可作为酵母总脂或中性脂的估测方法。

2.4 油红O和苏丹黑B染色显微观察定性分析中性脂累积

脂滴是中性脂的主要贮存场所，油红O和苏丹黑B是脂滴染色观察的常用染料。采用与定量测定相同的染色处理后，将酵母细胞制片在显微镜下观察并拍照（图4）。4种菌株被苏丹黑B染色后，胞内的脂滴呈现蓝黑色；被油红O染色，在荧光显微镜下观察胞内脂滴成亮红色，对脂滴的观察比苏丹黑B更清楚些。脂滴大小不一，散布在细胞质中，能明显看出pah1△-vector 菌株脂滴数目较野生型WT-vector明显降低；pah1△-Lipin1、tgl3/tgl4△-vector与WT-vector相比脂滴数目虽然差异不大，但是脂滴直径明显增大，表明有更多的中性脂积累。通过染色，显微观察脂滴数目和大小，只可定性分析中性脂含量。

2.5 酵母不同生长期中性脂积累动态

培养野生型菌株BY4741到稳定期后转接到新鲜培养基中，利用油红O比色法检测不同生长阶段的中性脂含量，绘出了生长曲线和中性脂含量动态图（图5）。酵母菌的生长周期遵循微生物的生长规律，在经历了几个小时的迟缓期后便进入了快速增殖的对数生长期，随着营养物质的消耗，增殖速度减慢，慢慢进入到稳定期（图5-A）。酵母菌中性脂含量随生长周期发生动态变化（图5-B），先是在迟缓期缓慢降低，进入对数生长期后急剧下降用于膜脂的形成和细胞的分裂增殖，随后中性脂含量慢慢积累，细胞增殖缓慢，在对数期后期或稳定期初期中性脂含量达到最高。

3 讨论

脂溶性的油红O是一种高效廉价的染色剂，能特异性结合中性脂（甘油酯和甾醇酯），并且在红光区域能产生激发光。利用油红O染色，在荧光显微镜下观察可定性分析中性脂含量，初步判断脂质聚集情况。油红O对细胞的染色程度与胞内中性脂含量呈正相关关系，利用乙醇或异丙醇将吸附的染料萃取出来，在510 nm下测定吸光度值，由线性回归方程计算出中性脂含量，能对胞内中性脂进行定量分析。针对酵母细胞壁厚，有机溶剂直接萃取效果差，本研究结合酸热法破壁，利用盐酸破坏细胞壁中的蛋白质和糖，使密致紧凑的细胞壁变得疏松，沸水浴进一步破坏细胞壁的完整性，能够达到快速高效的萃取结果。采用3种方法同时测定了4种酵母菌株中性脂的含量。甘油三酯试剂盒采用GPOPAP酶法测定甘油三酯（TAG）的含量，不仅作为辅助诊断，用于临床医疗机构检测人血清、血浆或组织中甘油三酯的浓度，而且已用于科研工作中检测脂肪沉积情况［21］。甘油三酯试剂盒结合薄层层析法的测定值可作为参考值，用改进后的油红O比色法测定的结果与参考值具有较高的一致性，证明该方法用于检测酵母细胞中性脂含量具有较高的可靠性。同时我们使用了另一种亲脂染料苏丹黑B，其对中性脂和极性脂均可着色，常用于总脂的分析［20］，该方法测得的中性脂含量与参考值也具有较高的一致性，但是由于其对细胞的着色较深及其亲脂性质，虽然延长了萃取时间和碱热处理时间也不能够完全萃取，因此降低了结果的可靠性，但可作为酵母中性脂含量的估测。本研究建立的油红O比色法检测酵母中性脂含量与以往的方法相比，不仅更加快速方便，仅需少量菌体，而且不需要使用有毒性的有机试剂进行繁琐的油脂提取，对仪器设备要求低，普通分光光度计即可满足要求，成本低，基本实验室均可进行。

磷脂酸磷酸酶PAH1与甘油三酯酯酶TGL3和TGL4对甘油三酯的合成与降解起到重要的调控作用。使用甘油三酯试剂盒检测pah1△-vector和tgl3/tgl4△-vector菌株甘油三酯含量，表明PAH1敲除后甘油三酯含量显著降低，而TGL3和TGL4敲除后甘油三酯含量明显提高。结合薄层层析法，tgl3/tgl4△-vector突变体的总中性脂含量也明显提高，而pah1△-vector突变体由于甾醇酯生成增多，总中性脂含量则表现出与野生型水平相当。用所建立油红O比色法检测两种敲除突变体中性脂的变化，结果与上述方法一致。而在PAH1敲除菌株中转入其在哺乳动物中的同源基因LTPIN1后，甘油三酯和总中性脂含量均明显提高。结果表明，通过基因工程，可改变酵母中性脂肪的组成及含量。因此，利用出芽酵母研究产油机制以提高产油能力具有重要意义。利用脂溶性染料对细胞染色后，观察中性脂的主要贮存场所脂滴［21］，通过对脂滴数目和直径的统计可定性分析中性脂的积累。其中所用菌株pah1△-vector通过油红O比色法检测的中性脂含量较野生型WT-vector没有变化，而脂滴数目较野生型明显降低，是由于其中性脂特别是甾醇酯聚集在膜结构中，不能通过显微观察到［7］。酵母中性脂随生长周期表现出动态变化，在经历了快速增殖的对数期后中性脂肪大量积累。油红O比色法能够成功监测到中性脂的积累动态，可为酵母油脂发酵时间提供参考。

酵母油脂的主要成分是中性脂，因此测定其中性脂含量对总脂含量的分析有很大参考意义。苏丹黑B比色法已用于总脂含量的分析中，本研究油红O的比色值与苏丹黑B具有较高的一致性，因此该方法也可用于总脂含量的分析中，作为高产油脂菌株筛选的新的检测手段。

4 结论

采用酸热法破碎细胞壁，能够完全萃取染色细胞中吸附的油红O，克服了直接萃取不完全，测定不准确的问题。利用甘油三酯试剂盒结合薄层层析法，验证了改进后的油红O比色法检测酵母中性脂含量的可靠性。该方法能够对不同酵母突变体中性脂进行定量分析，并成功监测酵母中性脂随生长周期的积累动态。因此，本研究建立的方法可用于酵母中性脂的快速检测，为高产油脂酵母菌株的选育及发酵控制提供一种新的检测方法。

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（责任编辑 马鑫）

Rapid Quantitation and Dynamic Accumulation Analysis of Neutral Lipids in Yeast

Du Xiuxiu Fang Zhijia Chen Zhongxiang Kuang Xin Huang Zhiwei
（College of Chemistry & Chemical Engineering and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620）

A colorimetric method for rapidly detecting neutral lipid content in yeast was developed, which was based on the staining of yeast cells by lipophilic dyes Oil red O or Sudan Black B and extraction with ethanol after cell rupturing using the method of combining hydrochloric acid or sodium hydroxide with heating. The extraction of Oil red O is better and the colorimetric results were more accurate, while Sudan Black B also can be used as an alternative dye for estimating neutral lipid content. Furthermore, the changes of neutral lipids in yeast mutated phospholipid fatty acid phosphatase（PAH1）and triglyceride lipase（TGL）, which are known as two key genes to regulate triglyceride metabolism, were studied using this method. Disruption of PAH1 resulted in a remarkable decrease in triglyceride content, although total neutral lipid levels did not change；while triglyceride and total neutral lipids contents were significantly accumulated in TGL knockout mutant. Finally, the dynamic changes of yeast neutral lipids content were successfully monitored with the change of growth phase by this method, suggesting that the neutral lipids were obviously accumulated after exponential phase.

Saccharomyces cerevisiaeNeutral lipids Lipophilic dyes Regulation of lipid metabolism

2013-12-18

国家自然科学基金项目（31100549），中央高校基本科研业务费专项资金项目（22320143-03）

杜秀秀，女，硕士生，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：duxiuxiu55@163.com

黄志伟，男，副教授，研究方向：分子遗传学；E-mail：zhiweih@dhu.edu.cn