杉木炭疽病拮抗菌AM53的发酵条件优化

杨菁 周国英 谭益民 路宗岩

（中南林业科技大学 教育部经济林培育与保护重点实验室，长沙 410004）

杉木炭疽病拮抗菌AM53的发酵条件优化

杨菁 周国英 谭益民 路宗岩

（中南林业科技大学 教育部经济林培育与保护重点实验室，长沙 410004）

旨在优化地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）AM53的发酵条件。通过Plackett-Burman试验筛选到影响AM53活菌数的重要因素为培养温度、初始pH、摇床转速。经最陡爬坡试验和Box-Behnken试验，获得AM53的最佳发酵条件为培养温度30.5℃，初始pH8，摇床转速185 r/min，接种量为5%，培养24 h。结果显示，在此条件下，OD600平均为1.861，其值与预测值基本相符，说明该模型可信度高，可应用于AM53发酵条件优化。

拮抗菌AM53 发酵条件 Plackett-Burman试验 Box-Behnken试验

炭疽菌的分布极为广泛，且寄主繁多，可侵害多种树木，尤其是对一些丰产速生林能够造成严重危害［1，2］。杉木炭疽病是杉木栽培区的主要发生病害之一，几乎有杉木的地区都会有炭疽病发生。病轻时，会导致杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严重时，常会造成杉木幼林成片的枯黄、枯死，对杉木林造成了毁灭性的损害［3-5］。因此，需要寻找一种高效、安全的防病方法来控制及预防该病在杉木上的扩散。利用生防细菌或其代谢产物来防治植物病害，使寄主植物周围的有益微生物和有害微生物达到平衡，从而起到防病增产的目的［6］。

发酵培养条件对微生物发酵液中的菌体含量和代谢产物都有较大的影响［7-9］。响应面分析法（Response surface methodology，RSM）可同时对影响响应值的各因子水平及他们的交互作用进行优化和分析，并快速有效地确定多个因子系统的最佳培养条件［10，11］。该方法可以减少试验步骤，提高准确性。本研究通过对从湖南攸县杉木根际土壤中筛选得到的杉木炭疽病拮抗细菌地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）AM53进行发酵条件的优化，旨在获得最佳的拮抗效果，为后续杉木炭疽病微生物制剂的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 指示菌株：杉木炭疽病的病原菌，由本实验室分离及鉴定，保藏于本实验室的菌种保藏中心，编号为CSUFTCC F0101。

拮抗菌株：地衣芽孢杆菌AM53，由本实验室分离、筛选及鉴定，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No. M2012273。

1.1.2 培养基 液体发酵培养基（NB液体培养基）：牛肉膏蛋白胨培养基。

平板培养基：PDA培养基，用于病原菌的活化及抑菌活性的测定。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备、发酵及菌体浓度的测定 菌悬液的制备：将斜面上生长良好的AM53菌株接种到含40 mL培养液的三角瓶中（100 mL），于28℃、160 r/min，振荡培养24 h后获得。

基础发酵条件：按照一定的比例接种种子悬液到含20 mL NB培养液的三角瓶中（100 mL），于一定温度下振荡培养24-48 h后制成种子液。

菌体浓度的测定：取AM53菌株发酵液，空白培养液作为对照，在722s可见分光光度计上测600 nm时菌液的 OD（optical density）值，以OD值的大小来表示菌体的浓度［12］。

1.2.2 Plackett-Burman试验设计 使用Design-expert 8.0 设计一个5因素2水平的Plackett-Burman（PB）试验，以菌体浓度OD600为响应值，从摇床转速、初始pH、温度、接种量和培养时间众多因素中，在最少的试验次数情况下，筛选出对菌体产量具有显著作用的因素。一般情况下，高水平（+）取低水平（-）的1.0-1.5倍［13］。PB试验各因素及其水平如表1所示。

1.2.3 最陡爬坡试验 在确定影响菌体浓度的显著性因素后，设计最陡爬坡试验，从而进一步确定各因素的变化方向和步长，以逼近最大的菌体产量的极值点。

1.2.4 Box-Behnken试验 应用Design-expert 8.0 设计的Box-Behnken design（BBD）试验法，包含了17个试验点，主要分为两类：析因点有12个，即为自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点；零点即区域中心点，零点试验重复5次，用于估计试验误差。最后通过对数据的分析，获得最佳的发酵条件。试验中各因素水平如表2所示。

2 结果

2.1 Plackett-Burman筛选试验

对PB试验结果（表3）进行方差分析，方差分析结果（表4）显示，对菌体产量影响较为显著的前3个因素分别为：培养温度（P=0.018）、初始pH（P=0.076）、摇床转速（P=0.090）。经过方差分析，获得多元一次不等式（已编码）：

OD600=0.92467+0.23033 摇床转速+0.24367初始pH-0.02900培养时间+0.06667接种量+0.36883培养温度

在该等式中，培养温度、初始pH，摇床转速的系数分别为+0.36883，+0.24367，+0.23033，均为正数，即培养温度、初始pH和摇床转速对OD600都呈正效应［14］，因而提高pH和摇床转速，升高培养温度能够增加OD600的值，即增加菌体浓度。根据Plackett-Burman的试验结果，设计最陡爬坡试验。

2.2 最陡爬坡试验

根据对Plackett-Burman试验结果的分析，设计爬坡试验，结果（表5）显示，最优的培养条件为处理3，因此以处理3中各因素的水平为Box-Behnken 试验的0水平点，设计试验。

2.3 Box-Behnken试验

采用Box-Behnken中心设计原理，对影响AM53菌株的活菌数的上述重要因素，即培养温度（℃）、初始pH和摇床转速（r/min），采用Design-expert V8.0软件对其进行3因素3水平的中心组合设计，试验因素水平设计以及结果见表6。

为考察各因素对AM53菌株活菌数的影响，以菌体发酵液在OD600的吸收值为指标，利用 Designexpert 8.0软件对表6中的试验结果进行分析，得到三因素与OD600值（Y）之间的回归方程：

Y=-36.555+1.519A+1.189B+0.113C+0.011AB+2.688E-5AC-6.900E-4BC-0.0265E-3A2-0.087B2-2.927E-4C2

二次多项式方程拟合的方差分析结果（表7）显示，本试验的回归模型达到了极显著水平（P＜0.0001），回归方程的相关系数R2=0.9889，说明该模型回归显著，另外，失拟项不显著（P=0.2518＞0.05，a=0.05），误差项不显著，表明实际情况与回归方程之间吻合度较好，试验误差较小，可用此回归方程代替试验真实点，对试验结果进行分析。另外，该回归模型各项的方差分析结果还表明，一次项和二次项都有较显著影响，则响应值的变化较为复杂，与各具体试验因素之间并不是简单的线性关系。因此在一定范围内可变动pH、培养温度和摇床转速之间的关系，从而使发酵液中的活菌数达到最高水平。

利用 Design-expert 8.0软件对表6中的试验结果进行二次多项式回归拟合，得到二次多项式回归方程的响应面图及等高线图（图1-图3）。

Design-expert 8.0软件对表6中的数据进行分析后，可得到发酵液的最大OD600值为1.864。各试验因素的最佳取值分别为：培养温度为30.52℃，初始pH为8.09，摇床转速为184.67 r/min。为了验证本次分析结果的准确性，结合实际情况，将菌株AM53发酵培养条件的最佳条件修正为：培养温度30.5℃，初始pH=8，摇床转速185 r/min，进行3次重复试验，所得发酵液的实际OD600值的平均值约为1.861。可见，实际结果与Design-expert 8.0软件的预测结果符合良好，说明采用响应面法（RSM）优化菌株AM53的发酵培养条件是可行的。

3 讨论

杉木炭疽病是潜伏侵染性的病害，针叶带菌率随着气温的升高而增加，到8月份达到最高。入秋后，温度适宜时又会有少量的植株感病；11月后逐渐下降，到3月底降到最低，4月份又开始回升，危害嫩叶、嫩梢。目前，已见报道的杉木炭疽病防治方法大多是营林防治和化学防治。其中，化学防治方法是在病害发生的早期，采用波尔多液、可湿性退菌特、多菌灵或炭疽福美等各药剂交替使用，从而防治杉木炭疽病的发生与扩散。但是，化学药剂基本上只有预防作用，却没有很有效的治疗作用［15-17］。同时，化学农药的使用，也会破坏了自然界的生态平衡。

本研究从杉木叶片中分离得到了杉木炭疽病的拮抗细菌AM53，并鉴定了该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。在抑菌试验过程中发现，新鲜的发酵液具有稳定的抑菌效果，这与发酵液中的活菌数、菌活力及代谢产物有着密切的关系，由于拮抗菌AM53的培养基是基础的细菌牛肉膏蛋白胨液体培养基，因而不再对其进行优化研究，对拮抗细菌AM53的发酵条件展开了优化研究。经过Plackett-Burman筛选试验表明，培养温度、初始pH和摇床转速对AM53活体数有显著的影响作用，且均为正效应。通过最陡爬坡试验的结果分析，找到逼近响应值的区域。最后通过对Box-Behnken试验结果的分析，找到拮抗菌AM53的最佳发酵条件，在该发酵条件下，拮抗菌AM53的平均OD值为1.861。

4 结论

本研究通过对杉木拮抗菌AM53的发酵条件进行优化，优化后培养条件为：培养温度30.5℃，初始pH=8，摇床转速185 r/min，接种量为5%，培养24 h。在此条件下，OD600平均值为1.861。经验证表明该模型能较好的预测该菌株实际发酵产酶的情况，说明该模型可以在实践中应用。

［1］ 林业部南方森林植物检疫所.杉木炭疽病的研究Ⅱ、症状和病原的探讨［J］.南京林产工业学院学报, 1980（2）：31-38.

［2］ Babu BK, Saxena AK, Srivastava AK, et al. Identification and detection of Macrophomona phaseolina by using species-specific oligouncleotide primers and probe［J］. Mycologia, 2007, 9：797-803.

［3］ 诸瑞龙.杉树炭疽病发病规律的探讨［J］.林业科技通讯, 1976（2）：13-14.

［4］ 江西森林病虫防治站等.杉木炭疽病的初步研究［J］.林业病虫通讯, 1976（1）：3-11.

［5］ 王军, 景何铭, 黄定芳.杉木炭疽病的发生规律及防治研究［J］.林业科学研究, 1996, 9（1）：97-100.

［6］ 路宗岩.杉木炭疽病拮抗细菌的筛选及其菌剂研制［D］.长沙：中南林业科技大学, 2012：8-9.

［7］ 谷春涛.地衣芽抱杆菌TS-01培养条件的研究［D］.北京：中国农业大学, 2004.

［8］ 唐娟.地衣芽孢杆菌C和L-3菌株生物活性的初步研究［D］.武汉：华中农业大学, 2008.

［9］ 纪明山, 王毅婧.地衣芽孢杆菌生防菌株SDYT-79发酵条件优化［J］.沈阳农业大学学报, 2011, 2（42）：164-169.

［10］ 万芳芳.高产甲壳素脱乙酰酶菌株的筛选及发酵研究［D］.长沙：中南林业科技大学, 2012.

［11］ 郝聚喜.玉米芯固定化脂肪酶及其催化转化生物柴油的研究［D］.长沙：中南林业科技大学, 2011.

［12］ 乔军, 孟庆龄, 贾桂珍. OD值法进行细菌计数的研究［J］.中国家禽, 1996（4）：26.

［13］ 孙晓鸣, 王萍, 邬向东.产中性蛋白酶芽孢杆菌配伍发酵响应面法研究［J］.中国食品学报, 2010, 10（2）：117-124.

［14］ 骆健华, 金志华, 岑沛霖.响应面法优化热带假丝酵母104菌株产羰基还原酶发酵培养基［J］.高校化学工程学报, 2006, 20（1）：68-73.

［15］ 王军, 景何铭, 黄定芳.杉木炭疽病的发生规律及防治研究［J］.林业科学研究, 1996, 9（1）：97-100.

［16］ 梁仰贞.油茶半边疯的发生与防治［J］.农家科技, 2006（3）：32.

［17］ 许彦君, 刘海龙, 刘新晶.细菌对植物病害生物防治研究进展［J］.大豆科技, 2011（5）：18-23.

（责任编辑 马鑫）

Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium AM53 Against Colletotrichum gloeosporioides

Yang Jing Zhou Guoying Tan Yimin Lu Zongyan
（The Key Laboratory for Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

It was to optimize the fermentation conditions ofBacillus licheniformis.The Plackett-Burman design was used to optimize the fermentation conditions, and the results showed that culture temperature, the initial pH and the rotating speed had significant influence on the count of the living AM53. After the steepest ascent test and Box-Behnken design, the optimal fermentation conditions of AM53 that we got were：culture temperature was 30.5℃, the initial pH was 8, rotating speed was 185 r/min and inoculation volume was 2%, cultured 24 hours. Under this condition, the average of OD600was 1.861, which means the experimental values agreed with the predicted values, the predicted model was reliable and available for the optimization of AM53 fermentation conditions

Antagonistic bacterium AM53 Fermentation conditions Plackett-Burman design Box-Behnken design

2013-12-10

林业公益性行业科研专项（201004014）

杨菁，女，硕士研究生，研究方向：应用微生物；E-mail：123196515@163.com

周国英，女，博士，教授，研究方向：林业微生物；E-mail：gyzhou2118@163.com