犬源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

赵相胜，孙 洋，纪 雪，刘 军，祝令伟，佟盼盼，冯书章

随着国民生活水平的提高及生活习惯的变化，宠物犬的数量日益增加。与家畜和多数经济动物相比，犬与人的接触更为密切，生活周期更长，这些都增加了人兽共患病原体在人犬之间传播的风险。为控制细菌性感染，宠物临床上广泛使用抗菌药物，滥用和不合理使用抗生素的问题日益严重，并由此导致细菌耐药性的增加与扩散。宠物细菌耐药性的产生不仅会影响治疗效果，更严重的是增加了宠物耐药菌传给人类的风险。鉴于此，近年来一些发达国家对犬的临床耐药菌的问题越来越重视[1-3]，我国也开始了这方面研究[4-5]。

本研究对东北地区犬携带的大肠杆菌进行分离鉴定和耐药性分析，提供了该地区犬源耐药性大肠杆菌的流行病学本底，为临床上正确选择抗菌药物、防治犬细菌性疾病提供科学依据，同时也为深入研究耐药性的水平传播机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1样品来源 2012年至2013年于吉林省1家宠物医院、2家宠物门诊和某军犬基地共采集191份犬肛拭子样品。

1.2试剂及培养基 氯霉素、四环素、氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、美洛培南、庆大霉素、复方新诺明、阿米卡星、多黏菌素B、环丙沙星和左氧氟沙星药敏片购自Oxoid公司；麦康凯琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌定位显色培养基购自法国科玛嘉公司；MH琼脂购自法国梅里埃公司；大肠杆菌质控菌株ATCC25922由本实验室保存。

1.3大肠杆菌分离鉴定 向有肛拭子样品的采集管中加入2 mL 0.85%生理盐水，室温振荡混匀10 min，静置3 min，吸取10 μL上清用接种环划线于麦康凯显色培养基平板上，37℃温箱培养过夜。挑取可疑红色菌落于大肠杆菌定位显色培养基划线纯化及鉴定。

1.4大肠杆菌分群鉴定 采用PCR方法对分离到的大肠杆菌进行分群鉴定，实验方法参考文献[6]，可将大肠杆菌分为A、B1、B2、D共4个群。大肠杆菌分群引物由invitrogen公司合成。

1.5药物敏感性检测 采用半定量琼脂扩散实验法，按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的操作程序进行[7]，同时用大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，参照CLSI的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)。多粘菌素的耐药判断按照丹麦细菌耐药监测系统(DAN-MAP)所使用的标准[8]。

2 结 果

2.1细菌分离鉴定 共分离到的254株大肠杆菌随机挑取10株菌进行16sDNA测序，BLAST比对结果全部为大肠杆菌，证明麦康凯显色培养基和科玛嘉定位显色培养基对大肠杆菌的特异性分离鉴定是可靠的。

2.2大肠杆菌分群 254株犬大肠杆菌多重PCR分群(图1)结果为：A群：117株；B1群：48株；B2群：36株；D群：53株。结果显示属A群的分离株较多，D群次之，B1、B2数目基本相当。一般认为B2和D群多属致病性的大肠杆菌[6]，这两群大肠杆菌占总分离数的35.04%。从表2可以看出，腹泻或者其他疾病病犬大肠杆菌分离株致病群的比例显著高于临床健康犬。

表1 大肠杆菌分群引物

表2 犬源大肠杆菌分离株分群结果

注：括号内为B2群和D群分离株所占百分比。

Note: The percentage of isolates of B2 group and D group are in the brackets.

2.3药物敏感性实验 犬源大肠杆菌分离株对氨苄西林和阿米卡星的耐药率最高，分别为75.98%和77.56%，对四环素的耐药率也达到68.90%，对美洛培南和多粘菌素B耐药率最低，分别为3.54%和3.94%。对其它抗生素耐药率在30%～60%之间。统计结果表明(表3)，分离于宠物医院样品的大肠杆菌对所测试的13种抗生素的耐药率均高于宠物门诊样品的分离株，军犬的耐药率最低。通过表4可以看出，犬源大肠杆菌致病群(B2和D群)分离株对头孢类抗生素的耐药率均高于A和B1群，对其他类抗生素的耐药谱无显著差异。

表3 犬源大肠杆菌对抗菌药物的敏感性

表4 犬源大肠杆菌药物敏感性与分群的相关性

2.3耐药谱分析 结果如表5所示，仅有8株分离株对13种药物全部敏感(3.15%)，有14株菌只对一种抗生素耐药，其余232株大肠杆菌表现为对2种以上抗菌药物耐药的不同多耐药表型。1～3种抗生素耐药菌株有59株(23.22%)；4～6种抗生素耐药菌株有63株(24.8%)；7～9种抗生素耐药菌株有58(22.8%)；10～12种抗生素耐药菌株有68株(26.77%)。

表5 254株犬源大肠杆菌的耐药模式

注：AM,氨苄西林；CTX，头孢噻肟；CRO,头孢曲松；CAZ,头孢他啶；MEM,美洛培南；CN,庆大霉素；AN,阿米卡星；LEV,左氧氟沙星；CIP,环丙沙星；TE,四环素；SXT, 磺胺甲基异恶唑；CHL,氯霉素；PB,多粘菌素

Note: AM--Ampicillin; CTX--Cefotaxime; CRO--Ceftriaxone; CAZ--Ceftazidime; MEM--Meropenem; CN--Gentamicin; AN--Amikacin; LEV--Levofloxacin; CIP--Ciprofloxacin; TE--Tetracycline; STX--Sulfamethoxazole; CHL--Chloramphenicol; PB--Polymixin B.

测试的13种抗生素可归为β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类、氯霉素类和多肽类抗菌药物。多重耐药表型一般定义为同时对≥3类抗生素耐药，统计结果表明(图1)，多重耐药菌数达187株(73.62%)，耐6类抗生素的最多，占比例29.53%，所耐抗生素的种类是β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、氯霉素类和磺胺类药物，有一株对7类抗生素均耐药。多重耐药菌株中最常出现的是β-内酰胺类耐药表型，为179株，占多重耐药菌株的95.72%。

图1犬源大肠杆菌分离株多重耐药模式

Fig.1PatternsofmultipleresistancesofEscherichiacolistrainsisolatedfromdogs

3 讨 论

本研究对我国东北地区犬源大肠杆菌的耐药情况进行了初步调查。实验选取对小动物临床用药频率高，且具有代表性的13种抗菌药物，囊括了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等7个大类。与国外研究结果相比，我国东北地区犬源大肠杆菌的耐药率更高，耐药谱更广。多重耐药菌的比例达到73%以上。对临床常用药物如氨苄西林、阿米卡星耐药率均在70%以上，四环素和喹诺酮类药物也达到60%左右。丹麦、葡萄牙、西班牙和瑞典等国家犬源大肠杆菌对绝大部分抗菌药物的耐药率都很低[2, 9-11]。丹麦健康犬肛拭子采集的大肠杆菌全部对头孢噻呋、庆大霉素和环丙沙星敏感，耐药率最高的是链霉素为9%。瑞典的犬源大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率为9%，对四环素和庆大霉素的耐药率分别为7%和1%，对氨苄西林的耐药率最高，为17%。西班牙健康犬粪便中分离的大肠杆菌大约有20%对四环素耐药、12%对氨苄西林耐药、15%对链霉素耐药，但对头孢他啶、头孢噻吩和阿米卡星敏感。比较可以看出，不同国家的宠物源大肠杆菌的耐药性差别较大，但基本上对氨苄西林、磺胺类药物、四环素等临床使用率高的药物耐药性较高，对头孢菌素类、氟喹诺酮类药物和阿米卡星等药物相对较敏感，而本研究这些种类的抗生素耐药率均明显高于国外。据2010年韩国的一项报道[3]，犬大肠杆菌分离株对药物的敏感率流浪犬分离株为38.4%、宠物医院分离株为26.7%，而本研究结果是对受试抗菌药物全部敏感的菌株只有3.15%，说明我国犬源大肠杆菌的耐药问题相当严重。

本研究发现，与宠物犬相比，军犬携带大肠杆菌的耐药率较低，耐药谱较窄，这在一定程度上与军犬规范用药和环境卫生相关。另外，宠物门诊的样品分离株耐药率低于宠物医院的分离株，而两者之间分群结果差异不大。

伴侣动物耐药菌产生与流行的问题已得到国内外的广泛关注[12]，抗生素用于伴侣动物的模式与畜禽的用药模式相比明显不同，前者与人类治疗疾病的模式有更多的相同点[13-14]。这提示伴侣动物耐药菌的形成与人类耐药菌的形成存在着某些共性，孕育着动物与人耐药性传播或互传的风险。耐药基因在犬和人类之间传播的报道也日益增多[15-16]，耐药菌可能直接通过犬传播给人，也可能通过环境在共同生活的人和宠物之间相互传播[17]。与其他国家相比，我国犬源耐药菌的问题更为严重。研究结果显示一些分离株对用于医学临床治疗的三代、四代头孢、喹诺酮类、甚至碳青霉烯类抗生素已经产生多重耐药表型，这是非常令人担忧的，也提醒我们对伴侣动物应该规范使用抗生素，以免造成更为严重的公共卫生问题。对于伴侣动物细菌耐药性的问题应引起足够的重视，积极开展宠物源细菌进行耐药性监测，并制订抗菌药物的使用规范。

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