金黄色葡萄球菌isdA基因对宿主上皮细胞免疫指标的影响

丛立新，李 蕾，于 录

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称金葡菌)是引起化脓性感染的重要人畜共患致病菌，能引发表皮感染，甚至心内膜炎、感染性皮炎、奶牛乳房炎及多种感染性疾病。自1960年首次发现耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MR-SA)以来，其耐药性迅速蔓延。细菌耐药性成为治疗金葡菌感染亟待解决的问题。脊椎动物含有丰富的具有血红素的血红蛋白，在感染过程中，金葡菌分泌溶血素，导致红细胞破裂而释放血红蛋白，优先地夺取和使用亚铁血红素上的铁，能够在体外利用完整的红细胞作为唯一的铁源，有了这些铁，金葡菌可在宿主体内定居并引起发病[1-2]。一些研究表明，铁表面调节因子IsdA(iron surface adjustment factors A)不仅仅可以与宿主血红蛋白和血红素相互作用，还可以粘附许多血清中或细胞外基质蛋白和人类角层细胞包膜蛋白[3]。此外，IsdA能降低菌体细胞的疏水性，使它们能够抵抗人体皮肤脂肪酸和肽的杀菌作用，对金葡菌在人体皮肤上的生存起到关键性作用[4]。本研究通过敲除毒力因子IsdA的编码基因，阻断金葡菌的侵袭，为日后金葡菌感染机制的研究奠定了基础，同时为以后抗金葡菌制剂及疫苗的研究开辟了新的途径。

1 材料与方法

1.1实验材料 人角质化上皮细胞Hacat购自ATCC(American Type Culture Collection)，本室常规传代。S.aureusNewman购自中国菌种保藏中心。敲除金葡菌野生株 Newman 的 isdA 基因，通过同源重组获得除 isdA 基因以外相同遗传背景的突变株与野生株，构建NewmanΔIsdA。

1.2主要试剂和实验仪器 RPMI-1640 培养基购自 Gibco 公司；胎牛血清购自 HyClone 公司；胰蛋白酶购自 Sigma 公司； Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所； PrimeScript®RT reagent Kit和SYBR®PremixEx Taq(ROXⅡ)购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)；DNase I 购自 Fermentas公司； ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Polyvinyliden edifluoride (PVDF)膜购自 Amersham 公司；鼠抗人 Dectin-1 抗体购自 R&D 公司、人源单抗 LL-37 购自Santa cruz 公司、鼠抗人 TLR2 和 TLR4 抗体购自 eBioscience 公司、鼠源单抗 β-actin和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠和羊抗兔IgG购自中杉金桥公司；人IL-8的ELISA检测试剂盒购自 Biolegend 公司；人 IL-6、TNF-α、MCP-1 的 ELISA 检测试剂盒购自 eBioscience 公司；彩色预染蛋白 marker(7-175kDa)购自 NEB 公司。

二氧化碳细胞培养箱(Thermo)，PCR扩增仪及梯度扩增仪(Biometra)，黑马凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)，垂直板电泳槽、湿法转膜槽及电泳仪(BioRad 公司)，水平摇床(鼎国生物公司)，酶标仪(芬兰雷勃)，倒置显微镜(上海万衡精密仪器有限公司)，恒温循环水浴锅(日本EYELA)，实验室碎花冰制冰机(日本 SANYO)，7500型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 公司)，化学发光呈像系统(DNR 公司)等。

1.3实验方法

1.3.1人Hacat上皮细胞的复苏及培养 取出液氮罐中冻存的人Hacat上皮细胞，立刻置于37 °C的恒温水浴锅中，迅速摇动，当细胞完全解冻后放入水平离心机中，1 000 r/min，离心7 min，弃上清，用含有100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1%丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酰胺、10%灭活胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，转移至25 mL细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，24 h后经倒置显微镜观察细胞形态，确定生长状态良好后使用预热的PBS清洗两遍，更换预热的细胞培养液，继续培养。采用胰酶和EDTA混合的消化法，将状态良好的细胞进行传代。

1.3.2ELISA法检测Newman及NewmanΔIsdA对上皮细胞趋化因子和细胞因子的影响 将人Hacat上皮细胞按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中。待细胞贴壁后换液，每孔加入含有5×106个细菌(50倍感染)的新鲜培养基300 μL，相同体积的培养基作空白对照，分别作用3 h、12 h和24 h后收集细胞上清，8 000 r/min离心20 min，去除沉淀后，吸出上清分别用人IL-8、IL-6、TNF-α和MCP-1的ELISA试剂盒检测细胞因子的表达水平，按照说明书操作。

1.3.3实时荧光定量PCR分析Newman及NewmanΔIsdA对上皮细胞炎性细胞因子、趋化因子、抗菌肽和相关受体mRNA表达水平的影响 将人Hacat上皮细胞按每瓶2×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中。待细胞贴壁后换液，每孔加入含有1×108个细菌(50倍感染)的新鲜培养基5mL，相同体积的培养基作空白对照，分别作用3 h、6 h、12 h和24 h后，提取总RNA进行实时荧光定量PCR分析。按照PrimeScript®RT reagent Kit说明书进行反转录。根据GenBank数据库中发表的人IL-6、IL-8、TNF-a、MCP-1、Dectin-1、LL-37、TLR2、TLR4和β-actin的mRNA基因序列，采用Oligo6生物软件设计Real-time PCR特异引物，并由上海生工合成见表1。

反应程序：95 ℃ 10 min预变性；95 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s；退火阶段结束开始收集荧光，40个循环。溶解度曲线程序设置：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。各个因子的退火温度50～60℃之间不等(表2)。

表1 基因、引物序列和扩增长度

表2 退火温度

1.3.4Western blot检测 将人Hacat上皮细胞按每瓶2×106个细胞接种于25 cm2培养瓶中。待细胞贴壁后换液，向细胞中分别每瓶加入含有1×108个Newman和NewmanΔIsdA(50倍感染)的新鲜培养基5 mL，设正常培养的Hacat上皮细胞为阴性对照，作用3 h。提取细胞总蛋白质并按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白质浓度。将提取的蛋白质进行SDS-PAGE、转膜、免疫反应及ECL显色发光等操作进行Western blot检测。

1.4统计学分析 采用GraphPad Prism 5[5]统计软件以及文献[6]中2-△△Ct法进行数据分析进行统计学分析，数据结果为平均值±标准差，P< 0.05时，平均值间差异被记作显著性差异。

2 结 果

2.1金葡菌newman IsdA+/-对人Hacat上皮细胞炎性细胞因子分泌的效果

2.1.1IsdA基因敲除后下调了Hacat上皮细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的表达水平 如图1所示，与金葡菌Newman组相比，金葡菌缺失IsdA后，细胞的促炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8的分泌水平下降；但与空白未刺激组相比，Newman及NewmanΔIsdA均可以促进细胞的促炎性细胞因子TNF-α，IL-6和IL-8(*P<0.05, **P<0.01)的释放分泌；其中IL-6和IL-8的变化较为明显，在3～12 h之间抑制最显著。

2.1.2IsdA基因敲除后抑制了Hacat上皮细胞单核细胞趋化蛋白MCP-1的分泌 收集金葡菌Newman及NewmanΔIsdA处理组的培养上清，ELISA方法检测细胞趋化因子MCP-1的分泌情况。金葡菌缺失IsdA基因后，Hacat上皮细胞单核细胞趋化蛋白MCP-1的分泌明显抑制，而在24 h最为明显。

图1 IsdA基因缺失后对Hacat细胞促炎性细胞因子分泌的影响

2.2金葡菌Newman IsdA+/-对Hacat细胞相关受体及细胞因子mRNA转录水平的影响 采用实时荧光定量 PCR 的方法，检测金葡菌 isdA+/-对 hacat 细胞 TLR2、TLR4、Dectin-1、LL-37 mRNA转录水平的变化和促炎性细胞因子 IL-6、IL-8 和 TNF-α 以及趋化因子 MCP-1 相应的 mRNA 表达量的变化分析了这7个基因在 3 h、6 h、12 h 和 24 h 的表达情况(如图2-4)。

金葡菌IsdA+/-处理Hacat细胞后，与对照组相比，促炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达量在刚加入菌液的3 h达到高峰，随着时间的延长而逐渐降低，而缺失IsdA后，3 h到12 h之间表达水平均明显下降(*P<0.05, **P<0.01)，IL-6和TNF-α的mRNA在24h变化无明显差异(P>0.05)，IL-8的表达水平却极显著下降(**P<0.01)。金葡菌IsdA+/-均可使细胞的MCP-1 mRNA转录水平上调(**P<0.01)，在3 h达到高峰。IsdA缺失后，3 h～12 h之间其表达均明显抑制，并在3 h抑制最明显；在24 h，IsdA缺失前后MCP-1的表达无明显差异(P>0.05)(图2)。 TLR2 和 TLR4 表达量在刚加入菌液的 3h 开始上升，TLR2 在 12h 达到高峰，随着时间的延长而逐渐降低。而在 3h～24h 之间，isdA-组的 TLR2 和 TLR4 的表达水平明显低于 isdA+组(*P<0.05，**P<0.01)(图3)。 Hacat上皮细胞经过金葡菌IsdA+/-作用3～12 h后，与空白对照组相比，明显上调了抗炎性细胞因子Dectin-1和LL-37 mRNA的表达(*P<0.05,**P<0.01)。IsdA缺失后，3h～12h之间其表达水平均明显下调，并在3 h下降最明显；而作用24 h后，却无明显变化(P>0.05)(图4)。Hacat细胞可以自身表达TLR2、TLR4、Dectin-1、LL-37、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1，且在3 h～24 h之前的表达并无明显差异；进行金葡菌处理后，mRNA的转录水平可以不同程度的升高。而缺失IsdA基因后表达水平均明显下调，个别因子在24 h无明显变化，但仍然显著高于对照组。

2.3Newman及NewmanΔIsdA对上皮细胞Toll样受体、Dectin-1和抗菌肽LL-37蛋白水平变化的影响 金黄色葡萄球菌可促进 Hacat 上皮细胞 TLR2、TLR4、Dectin-1 和 LL-37 蛋白表达上调，TLR2 比 TLR4 上调明显；而缺失 IsdA 基因后，这4个蛋白表达均下降。

图2 IsdA基因敲除对Hacat上皮细胞IL-8I、L-6、TNF-α和MCP-1 mRNA表达的影响

图3 IsdA基因缺失对Hacat上皮细胞表面受体TLR2和TLR4 mRNA表达的影响

图4 IsdA基因缺失对Hacat上皮细胞Dectin-1与LL37 mRNA表达的影响

3 讨 论

金葡菌因表达大量毒力因子而被称为最具致病力的细菌之一。金葡菌可引起包括皮肤感染在内的一系列感染，严重时甚至可以威胁人类的生命。角质化上皮细胞作为金葡菌感染的目标细胞，在金葡菌感染的先天免疫和炎症反应中扮演重要的角色，具有炎性介质合成和释放的能力，是宿主皮肤炎症的积极参与者。人们发现金葡菌表面蛋白IsdA对细菌细胞的表面疏水性的降低可以使它们具有杀菌作用，对人体皮肤上的金葡菌的生存非常必需[7]。因此，本研究选择了人的角质化上皮细胞Hacat做为细胞模型，在体外研究了金葡菌IsdA+/-对上皮细胞活性的影响。

图5IsdA基因缺失对Hacat上皮细胞TLR2、TLR4、Dectin-1与LL-37蛋白表达的影响

Fig.5EffectsofIsdAdeletiononTLR2,TLR4,Dectin-1andLL-37proteinexpressioninHacaTkeratinocytes

哺乳动物先天免疫系统是通过模式识别受体(PRRs)进而检测病原微生物感染。PRRs包括Toll样受体(TLRs)、Nod样受体(NLRs)和RIG样受体(RLRs)三个家族，TLRs是现在研究比较成熟的受体家族，一些TLRs(TLR2和TLR4)在细胞表面上表达，识别病原体相关分子模式(PAMPs)，在天然免疫和获得性免疫中均有重要作用。最近有研究证明金葡菌细胞壁上的结合蛋白具有作为宿主细胞表面TLR2原始配体的功能。然而该细胞表面结合蛋白有效识别TLR2的机制仍然不清楚；也有证据表明，TLR2在金葡菌中起着调节宿主反应的重要作用。事实上TLR2缺陷型小鼠对金葡菌感染高度敏感[8]。金葡菌可导致皮肤细胞的TLR2表达显着增加，从而提高了皮肤感染症状发展过程中宿主皮肤对细菌的敏感性。此外，据报道，细菌致脓毒血症儿童血清细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8水平明显升高[9]。本实验结果与此相一致：葡萄球菌可以明显上调Hacat上皮细胞的TLR2表达水平，金葡菌增加炎性细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达，而TLR4的表达上调并不显著。本研究发现金葡菌作用于上皮细胞后，可显著的上调上皮细胞模式识别受体TLR2、TLR4、Dectin-1和抗菌肽的表达，并促进炎症细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α和趋化因子MCP-1的产生。

IsdA是一个多功能的表面蛋白，野生型金葡菌诱导上皮细胞的细胞因子产生，从而导致体内发生炎症反应，而IsdA基因缺失的金葡菌诱导上皮细胞的细胞因子水平降低，因此我们推测IsdA是金葡菌的重要毒力因子之一。在本实验中毒力因子IsdA被敲出后的金葡菌与野生株相比，IsdA基因缺失后的金葡菌降低了Hacat上皮细胞细胞因子IL-8、TNF-α、IL-6和MCP-1的分泌水平和TLR2、TLR4、Ddectin-1和LL-37的蛋白表达水平，但高于空白对照组。证实了IsdA被敲出后的金葡菌的感染力下降，为日后金葡菌病的防治开辟了新的途径。

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