杏鲍菇原生质体制备条件的研究
2014-04-09何小慧杨民和
何小慧+杨民和
摘 要：通过对酶系、酶解浓度、酶解时间、酶解温度、酶解pH值、稳压剂浓度和杏鲍菇出发菌龄的探索，得出杏鲍菇原生质体制备的条件。其制备条件为：培养5d的菌丝，在0.6mol/L甘露醇配制的2%溶壁酶里，pH 5.5，30℃，50r/min，酶解2.5h，可以获得较高的原生质体产量，产量为6.10×106 个/mL。
关键词：杏鲍菇；原生质体；制备条件
中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）06-15-03
杏鲍菇隶属于担子菌亚门、真担子菌纲、层菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，营养丰富，是侧耳属中风味较好的一类，有着广阔的市场前景[1-2]。目前食用菌育种方法有野生食用菌驯化育种、孢子分离育种、杂交育种（单倍体交配）、诱变育种、细胞融合育种及转基因育种等方法[3]。食用菌的原生质体全能性较易得到，所以细胞融合育种将为更广泛的使用。研究杏鲍菇原生质体制备的条件，就是为对其进行细胞融合育种创造条件。由于真菌细胞的细胞壁成分较为复杂，不同种甚至同种不同菌株之间的原生质体制备条件也需要进行原生质体制备的条件摸索[4]。根据同类食用菌原生质体制备技术的文献[5-6]，本文对杏鲍菇原生质体的制备条件进行探索。
1 材料与方法
1.1 菌株 本实验室分离，子实体采自福建省福清市火麒麟食用菌技术开发有限公司。
1.2 水解酶 溶壁酶（Lywallzyme），购自广东微生物研究所；纤维素酶（cellulase），购自阿拉丁；蜗牛酶（snailase），购自北京鼎国昌是生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 PDA培养基 将200g马铃薯煮至软烂过滤取汁，加入葡萄糖20g，加水至1 000mL，pH自然。培养基经常规高压灭菌后备用。
1.3.2 菌丝体的培养 菌种于PDA培养基上活化培养，从生长良好的菌落边缘用10mm打孔器打取菌丝块，接4块菌饼到铺有玻璃纸的PDA平板培养基上，28℃恒温箱中培养4～7d。
1.3.3 酶液的配制 称取一定量的酶溶于0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂中，调到需要的酶浓度（m/v），用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤除菌后备用。
1.3.4 原生质体的制备 挑取培养好的菌丝置于无菌的10mL离心管中，加入一定量酶液进行酶解，因为菌丝长在玻璃纸上，没有混杂培养基成分，无需洗涤可以直接用于酶解[7]。酶解一定时间后，吸取菌悬液，用血球计数板进行计数，计算原生质体的数量。
1.3.5 原生质体制备条件的确定
1.3.5.1 酶系的选择 用0.6mol/L甘露醇配置以上酶系，pH4.6，30℃，50r/min的条件下酶解菌丝3.0h，然后显微镜下进行计数，计算原生质体的数量。
1.3.5.2 酶浓度的确定 分别用0.6mol/L的甘露醇配置不同浓度的酶液，溶壁酶的浓度（M/V）分别设置为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%。在30℃，pH4.6，50r/min，酶解菌丝3.0h，然后显微镜下进行计数。
1.3.5.3 酶解时间的确定 酶解时间设置为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h和3.5h，在30℃，pH4.6的0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min条件下酶解菌丝，然后显微镜下进行计数。
1.3.5.4 酶解pH的确定 酶解环境分别设置了4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0等不同的pH值。在30℃，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。
1.3.5.5 酶解温度的确定 分别设置酶解温度为26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。
1.3.5.6 稳压剂浓度的确定 根据参考文献《杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探》和《杏鲍菇原生质体制备技术的研究》得出，此菌使用甘露醇作为稳定剂最佳，进而在此设计浓度不同的甘露醇溶液配制的2.0%酶液进行试验，稳压剂浓度分别为0.4M/L、0.5M/L、0.6M/L、0.7M/L和0.8M/L，30℃，pH5.5，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。
1.3.5.7 最佳菌龄的确定 菌丝体在培养3d、4d、5d、6d、和7d后，分别在30℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min的条件下，酶解菌丝2.5h，然后显微镜下进行计数。
2 结果与讨论
2.1 酶系的选择 蜗牛酶主要作用是降解几丁质，纤维素酶主要是将纤维素分解成寡聚糖和单糖，溶壁酶是一种复合型水解酶，能分解真菌细胞壁。蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶都普遍应用于真菌原生质体的制备，大多数食用的大型真菌使用溶壁酶或者溶壁酶和纤维素酶混合液进行原生质体制备，但是不同的菌类也有用蜗牛酶和纤维素酶进行原生质体制备的报道[8-9]。相对溶壁酶来说，若能使用蜗牛酶和纤维素酶进行原生质体制备，则能节约成本，因而对常用的这3种酶分别进行单一酶系和混合酶系对杏鲍菇菌丝进行酶解。从图1可以看出，单一使用溶壁酶就能获得较多的杏鲍菇原生质体。杏鲍菇菌丝对一般的纤维素酶和蜗牛酶不敏感，酶解3.0h还未能在显微镜下找到解开的菌丝碎片和原生质体，但是使用单一的溶壁酶能得到较好的酶解效果，酶解3.0h后，原生质体的浓度达到3.75×106个/mL。
2.2 酶浓度对原生质体制备的影响 酶的浓度会对真菌原生质体的形成有一定影响。在一定的浓度范围内，酶浓度越高，原生质体产量增加明显；但是当酶浓度过大时，则会破坏原生质体，影响原生质体的制备。从图2可以看出，当溶壁酶浓度为2.0%（M/V）的时候，原生质体产量最高，达到4.35×106 个/mL。
2.3 酶解时间对原生质体制备的影响 菌丝酶解一定时间，有活性的原生质体产量会不断增加，但是酶解时间过长，就会造成原生质体长时间浸泡在酶液中导致细胞破裂，活性原生质体数目下降。由图3可以看到，酶解2.5 h的时候，活性原生质体产量达到最高，浓度为4.7×106 个/mL。
2.4 pH值对原生质体制备的影响 酶在不同pH值环境下活性不一样，pH值会影响酶的作用效果；不仅如此，pH值还会影响细胞膜的稳定性，过高或过低的pH值都会对细胞膜产生不利影响[10]。根据图4得出，当pH5.5的时候，原生质体产量最高，浓度为4.87×106个/mL；pH接近中性时，原生质体产量明显下降。
2.5 温度的选择 酶解温度不仅会影响酶的活力，也会影响原生质体的活力，所以酶解温度偏高或偏低都会对最后形成的原生质体数量有一定影响。由图5得出，温度在30℃以下，原生质体产量明显低于30℃及以上两个温度，并且温度为30℃时，原生质体产量最高，原生质体浓度为4.1×106个/mL。说明在30℃时，此酶的活性高，杏鲍菇的原生质体产量高。
2.6 稳压剂浓度的选择 稳压剂的存在，不仅能保证原生质体细胞膜内外压力的恒定，保证原生质体不易破裂，还有可能会促进酶与底物的结合。由图6可以得出，渗透压稳定剂浓度过高或者过低对原生质体的产量影响较明显。本研究中，甘露醇浓度为0.6mol/L时杏鲍菇原生质体产量最高，浓度达到6.05×106个/mL。
2.7 菌龄的选择 菌丝的培养时间对原生质体的制备存在较大的影响，菌丝在不同的时期细胞壁结构、菌体代谢水平和菌体活力都不一样，不同菌在不同时期用于制备原生质体产量也不一样[11]。培养时间短，菌丝体产量低，不足够酶解；而培养时间过长，则有可能导致菌丝老化难以被酶解。由图7可以看到，杏鲍菇菌丝体培养5d后，制备的原生质体数量最多，浓度达到6.10×106个/mL。
3 小结
通过以上单一变量的试验表明，采用平板法培养菌丝5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作为稳压剂，2.0%浓度的单一溶壁酶条件下酶解菌丝2.5h，杏鲍菇的原生质体制备效果最佳，其产量可以达到6.10×106个/mL。这一试验表明对杏鲍菇进行细胞融合育种是可以进行的，可以完成构建新品种的杏鲍菇的目的。
参考文献
[1]冯伟林，蔡为明，金群丽，等.杏鲍菇担孢子交配型的鉴定分析[J].浙江农业学报，2010，22（1）：100-104.
[2]王爱仙.不同碳氮比培养料对杏鲍菇菌丝生长的影响[J].浙江食用菌，2010，18（4）：20-21.
[3]桂明英，王刚，郭永红，等.食用菌育种技术的研究进展[J].中国食用菌，2006，25（5）：3-5.
[4]付晓燕，范黎.粗柄羊肚菌原生质体制备及再生技术[J].现代农业科学，2009，16（5）：35-37.
[5]刘敏，李娟，周波，等.杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探[J].生物技术，2005，15（1）：54-55.
[6]陈敏，蒋予箭，姚善泾，等.杏鲍菇原生质体制备技术的研究[J].食品科学，2005，26（8）：155-152.
[7]陈漱涢，曹卫军.几种丝状真菌原生质体的形成与再生[J].真菌学报，1986，5（2）：177-123. [8]何强泰，张李杨.大型真菌原生质体技术的研究进展[J].南京晓庄学院学报，2001，17（4）：47-50.
[9]刘玉霞，王谦，陈瑞玲，等.白灵菇原生质体制备及再生的研究[J].食用菌，2009，（4）：24-25.
[10]金卫根.高大环柄菇原生质体制备的研究[J].江西农业学报，2009，21（4）：111-113.
[11]谭文辉，李燕萍，许洋.微生物原生质体制备及再生的影响因素[J].现代食品科技，2006，22（3）：263-265.
（责编：张长青）
2.3 酶解时间对原生质体制备的影响 菌丝酶解一定时间，有活性的原生质体产量会不断增加，但是酶解时间过长，就会造成原生质体长时间浸泡在酶液中导致细胞破裂，活性原生质体数目下降。由图3可以看到，酶解2.5 h的时候，活性原生质体产量达到最高，浓度为4.7×106 个/mL。
2.4 pH值对原生质体制备的影响 酶在不同pH值环境下活性不一样，pH值会影响酶的作用效果；不仅如此，pH值还会影响细胞膜的稳定性，过高或过低的pH值都会对细胞膜产生不利影响[10]。根据图4得出，当pH5.5的时候，原生质体产量最高，浓度为4.87×106个/mL；pH接近中性时，原生质体产量明显下降。
2.5 温度的选择 酶解温度不仅会影响酶的活力，也会影响原生质体的活力，所以酶解温度偏高或偏低都会对最后形成的原生质体数量有一定影响。由图5得出，温度在30℃以下，原生质体产量明显低于30℃及以上两个温度，并且温度为30℃时，原生质体产量最高，原生质体浓度为4.1×106个/mL。说明在30℃时，此酶的活性高，杏鲍菇的原生质体产量高。
2.6 稳压剂浓度的选择 稳压剂的存在，不仅能保证原生质体细胞膜内外压力的恒定，保证原生质体不易破裂，还有可能会促进酶与底物的结合。由图6可以得出，渗透压稳定剂浓度过高或者过低对原生质体的产量影响较明显。本研究中，甘露醇浓度为0.6mol/L时杏鲍菇原生质体产量最高，浓度达到6.05×106个/mL。
2.7 菌龄的选择 菌丝的培养时间对原生质体的制备存在较大的影响，菌丝在不同的时期细胞壁结构、菌体代谢水平和菌体活力都不一样，不同菌在不同时期用于制备原生质体产量也不一样[11]。培养时间短，菌丝体产量低，不足够酶解；而培养时间过长，则有可能导致菌丝老化难以被酶解。由图7可以看到，杏鲍菇菌丝体培养5d后，制备的原生质体数量最多，浓度达到6.10×106个/mL。
3 小结
通过以上单一变量的试验表明，采用平板法培养菌丝5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作为稳压剂，2.0%浓度的单一溶壁酶条件下酶解菌丝2.5h，杏鲍菇的原生质体制备效果最佳，其产量可以达到6.10×106个/mL。这一试验表明对杏鲍菇进行细胞融合育种是可以进行的，可以完成构建新品种的杏鲍菇的目的。
参考文献
[1]冯伟林，蔡为明，金群丽，等.杏鲍菇担孢子交配型的鉴定分析[J].浙江农业学报，2010，22（1）：100-104.
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[7]陈漱涢，曹卫军.几种丝状真菌原生质体的形成与再生[J].真菌学报，1986，5（2）：177-123. [8]何强泰，张李杨.大型真菌原生质体技术的研究进展[J].南京晓庄学院学报，2001，17（4）：47-50.
[9]刘玉霞，王谦，陈瑞玲，等.白灵菇原生质体制备及再生的研究[J].食用菌，2009，（4）：24-25.
[10]金卫根.高大环柄菇原生质体制备的研究[J].江西农业学报，2009，21（4）：111-113.
[11]谭文辉，李燕萍，许洋.微生物原生质体制备及再生的影响因素[J].现代食品科技，2006，22（3）：263-265.
（责编：张长青）
2.3 酶解时间对原生质体制备的影响 菌丝酶解一定时间，有活性的原生质体产量会不断增加，但是酶解时间过长，就会造成原生质体长时间浸泡在酶液中导致细胞破裂，活性原生质体数目下降。由图3可以看到，酶解2.5 h的时候，活性原生质体产量达到最高，浓度为4.7×106 个/mL。
2.4 pH值对原生质体制备的影响 酶在不同pH值环境下活性不一样，pH值会影响酶的作用效果；不仅如此，pH值还会影响细胞膜的稳定性，过高或过低的pH值都会对细胞膜产生不利影响[10]。根据图4得出，当pH5.5的时候，原生质体产量最高，浓度为4.87×106个/mL；pH接近中性时，原生质体产量明显下降。
2.5 温度的选择 酶解温度不仅会影响酶的活力，也会影响原生质体的活力，所以酶解温度偏高或偏低都会对最后形成的原生质体数量有一定影响。由图5得出，温度在30℃以下，原生质体产量明显低于30℃及以上两个温度，并且温度为30℃时，原生质体产量最高，原生质体浓度为4.1×106个/mL。说明在30℃时，此酶的活性高，杏鲍菇的原生质体产量高。
2.6 稳压剂浓度的选择 稳压剂的存在，不仅能保证原生质体细胞膜内外压力的恒定，保证原生质体不易破裂，还有可能会促进酶与底物的结合。由图6可以得出，渗透压稳定剂浓度过高或者过低对原生质体的产量影响较明显。本研究中，甘露醇浓度为0.6mol/L时杏鲍菇原生质体产量最高，浓度达到6.05×106个/mL。
2.7 菌龄的选择 菌丝的培养时间对原生质体的制备存在较大的影响，菌丝在不同的时期细胞壁结构、菌体代谢水平和菌体活力都不一样，不同菌在不同时期用于制备原生质体产量也不一样[11]。培养时间短，菌丝体产量低，不足够酶解；而培养时间过长，则有可能导致菌丝老化难以被酶解。由图7可以看到，杏鲍菇菌丝体培养5d后，制备的原生质体数量最多，浓度达到6.10×106个/mL。
3 小结
通过以上单一变量的试验表明，采用平板法培养菌丝5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作为稳压剂，2.0%浓度的单一溶壁酶条件下酶解菌丝2.5h，杏鲍菇的原生质体制备效果最佳，其产量可以达到6.10×106个/mL。这一试验表明对杏鲍菇进行细胞融合育种是可以进行的，可以完成构建新品种的杏鲍菇的目的。
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[4]付晓燕，范黎.粗柄羊肚菌原生质体制备及再生技术[J].现代农业科学，2009，16（5）：35-37.
[5]刘敏，李娟，周波，等.杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探[J].生物技术，2005，15（1）：54-55.
[6]陈敏，蒋予箭，姚善泾，等.杏鲍菇原生质体制备技术的研究[J].食品科学，2005，26（8）：155-152.
[7]陈漱涢，曹卫军.几种丝状真菌原生质体的形成与再生[J].真菌学报，1986，5（2）：177-123. [8]何强泰，张李杨.大型真菌原生质体技术的研究进展[J].南京晓庄学院学报，2001，17（4）：47-50.
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[10]金卫根.高大环柄菇原生质体制备的研究[J].江西农业学报，2009，21（4）：111-113.
[11]谭文辉，李燕萍，许洋.微生物原生质体制备及再生的影响因素[J].现代食品科技，2006，22（3）：263-265.
（责编：张长青）
