芽孢杆菌对肠道菌群结构影响的研究进展

吴高峰，黄占旺

（江西农业大学 食品科学与工程学院/江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045)

益生菌(probiotics)是指对人和动植物有益的菌，应用于人体的益生菌有双歧杆菌、乳杆菌、枯草芽孢杆菌(含纳豆芽孢杆菌)、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌等[1]，可见芽孢杆菌在益生菌中占有很大的比重。芽孢杆菌(Bacillus)是指能形成芽孢的杆菌或球菌，对外界有害因子抵抗力强、繁殖速度快，生存能力强，广泛存在于动物肠道中。

1 芽孢杆菌对肠道菌群的调节

人和动物的胃肠道栖息的细菌大约有30个属500多种，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中专性厌氧菌占99%以上。肠道中的细菌根据它们的功能可分为三个部分：生理性细菌、条件致病菌和病原菌。生理性细菌为专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，如双歧杆菌等，芽孢杆菌属于此类。下面介绍几种芽孢杆菌对肠道菌群的调节。

1.1 纳豆芽孢杆菌对肠道菌群的调节

纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是具有耐酸、耐热特性的有益菌，在胃酸下4h存活率为100%，是各种有益菌当中对环境耐受力最好并且可以直达小肠的菌种之一。它能改变人体肠道细菌丛生态，具有强力的病原菌抑制能力，可以产酸，调节肠道菌群。陈兵等[2]发现纳豆芽孢杆菌增加了肠道厌氧菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、梭菌和拟合杆菌数量，而减少了肠杆菌、肠球菌等需氧菌群数量。黄俊才等[3]发现纳豆芽孢杆菌显著提高了仔猪结肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌数量，与甘露聚糖(MOS)联用时大肠杆菌数量显著下降且粘膜上乳酸杆菌数量上升。吴德华等[4]研究发现，添加不同浓度的纳豆芽孢杆菌显著增加了乳酸杆菌数量而极显著降低大肠杆菌数量，而未添加纳豆芽孢杆菌大肠杆菌数量却极显著上升。试验证明，添加纳豆芽孢杆菌有助于增加胃肠道的益生菌生长，而对需氧菌或肠杆菌肠球菌等产生拮抗作用，减少致病菌的定植。

1.2 地衣芽孢杆菌对肠道菌群的调节

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是芽孢杆菌中具有较大潜力的菌种之一，它能够通过以菌治菌、生物夺氧的方法抑制致病菌的生长。郭贵海等[5]发现地衣芽孢杆菌口服后以活菌方式进入肠道并产生短杆菌肽、枯草杆菌肽、制霉菌素和头孢菌素C等抗菌活性物质，抑制肠道中的致病菌。刘波等[6]研究发现，投喂地衣芽孢杆菌，异育银鲫食糜中芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量显著增加，而大肠杆菌的数量显著降低。全艳玲等[7]运用菌菌混合培养，发现地衣芽孢杆菌对病原微生物具有抑制作用，而对双歧杆菌、乳酸菌有促进或共生作用。景翠等[8]发现日粮中添加地衣芽孢杆菌对平衡肠道菌群、改善肠道形态结构效果明显。

1.3 枯草芽孢杆菌对肠道菌群的调节

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性需氧菌，对大肠杆菌等有害微生物有很强的抑制作用。李卫芬等[9]研究发现，饲喂基础日粮加枯草芽胞杆菌制剂组肉鸡空肠和盲肠内容物中乳酸菌、芽孢杆菌数量显著增加，而大肠杆菌数量显著降低。说明枯草芽孢杆菌也能促进厌氧菌而抑制需氧菌的生长，从而调节肠道菌群。枯草芽孢杆菌能够很好地调节肠道微生态系统，是因为迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制致病菌生长。

2 芽孢杆菌调节肠道菌群的研究方法

2.1 取 样

研究肠道菌群，首先进行的就是取样，常用方法是粪便取样和肠道内容物取样。粪便取样常采用逼迫法，即在无菌环境下取小鼠粪便几颗，置于灭菌后的离心管中，加入几粒小的钢珠，进行离心，即为所需样品。肠道内容物取样一般在无菌条件下从结肠(肠襻中部)中取内容物，洗去食糜，于灭菌离心管中离心得到样品[10]；另外用灭菌载玻片刮取肠壁粘膜，并测量其肠内壁面积，计数后计算每平方厘米的粘膜中各种菌的数量[3]。

2.2 检 测

人体内的微生物以细菌为主，重量约为1.5~2kg，其中肠道中约有1kg以上，每克肠道内容物中栖居约1012个细菌，含有至少500个种，其中厌氧菌占优势。研究肠道菌群，过去通常采用分离纯化后鉴定，随着检测技术水平的提高，检测肠道菌群的方法也越来越先进。笔者将其分为两类进行介绍：传统检测方法和现代检测方法。

(1)传统检测方法。传统的检测方法主要是利用细胞培养法。采用平板涂布法分离纯化，再用特殊培养基BS(厌氧菌)和EC(需氧菌)，然后在37℃恒温培养箱内培养48h，挑取各典型菌落，通过划线法再培养，获得的菌株根据其形态特征、培养性状和生化反应特性进行分析鉴定。针对厌氧菌和需氧菌的鉴定，笔者从革兰氏染色的结果、形态及排列、有无荚膜及芽孢、有无鞭毛以及在特殊培养基和血琼脂培养基上的培养特征，确定肠道菌群中细菌类型[2,7]。细胞培养法虽然在检测菌群具有典型性、高灵敏性、特异性，但因为过程的复杂性和效率低，通常需要花费48h甚至更长时间[11]。可培养的微生物仅占微生物总数的0.1%~10%[12]，因此忽略了大量的不可培养的微生物，分析时往往低估肠道菌群的多样性，很难全面的反映肠道菌群的结构特征。培养基的差异以及培养方法的敏感性也会使得试验结果不同，导致分度低的细菌漏检和过低估计[13]。

(2)现代检测方法。随着现代微生物学和分子生物学的快速发展，肠道菌群检测方法也更加全面、准确。现代检测技术能够更有效的分析生物多样性，而且可以推测到菌株间的亲缘关系，对深入了解益生菌及其在肠道中的功能将有重大帮助。研究肠道菌群的现代检测技术方法种类繁多，下面介绍几种典型的技术。

① 质谱分析(MS)。近年来质谱分析有了显著的发展，尤其是MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)的应用，可以解决细菌的全菌分析。该技术直接在样品板上涂样品，点加基质后进行分析，通过数据库检索配对或者与已知的细菌进行比较，实现细菌的鉴定。在对MALDI-TOF-MS技术作进一步可行性评估发现，它可用于快速准确的微生物分析，可以在最小的细胞数量和混合菌群中识别细菌，能对大量的目标进行分析，不需要事先选择特定的抗体或者底物识别[14]。有文献研究表明，运用PCR与MALDI-TOF-MS结合，可实现快速鉴定细菌[15]。虽然该技术操作简单，但因为已有的图谱很少，所以只能鉴定部分的菌株[16]。

② 高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法是将样品稀释离心，通过弱阴离子交换色谱进一步除杂，再将细菌样品置于高效液相阴离子交换色谱分离，分离完成后用洗脱液洗出细菌完整细胞，最后将洗出液进行紫外吸收和光散射检测器检测。高效液相色谱法经过显微镜检查，平板培养，色谱分析，软件计算出脱峰面积，通过与菌落计数结果比较其相关性。这一方法的最大特点之一是样品的非破坏性，有可能真实地反映所研究体系中微生物的组成和生存状态。虽然它可以可靠的应用于同一个体在不同生理条件下对肠道菌群研究或不同个体之间的研究，但是对细菌种群的确定需进一步研究[17]。

③ 16S rRNA/16S rDNA。16S rRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立，为正确定量检测肠道中的细菌菌群数量提供一种特异性高、灵敏性强的试验方法。16S rRNA主要包括三个步骤：基因组DNA获得，16S rRNA基因片段获得，16S rRNA基因序列分析[18]。RFLP(限制性片段长度多态性)是典型的一种运用16S rDNA方法来分析肠道微生物的现代检测方法，它包括细菌总DNA的提取、细菌16S rDNA片段的PCR扩增与纯化、16S rDNA克隆文库的构建、文库的统计分析和测序与序列分析。RFLP虽然可以直接定量分析，但是很多条带与群落成员无关。TRFLP(终端限制性片段长度多态性)可以用于分析个体间肠道微生物的快速筛选，TRFLP具有高分辨率、可以在泳道内标记、直接定量分析片段，但无法获得种系发生信息，而且设备昂贵，虽可估计系统发育多样性和在各种环境样品中的微生物组成，不能用于一个特定大量细菌的定量[19]。16S rDNA具有高度保守性和种属差异性、普遍性和准确性，但存在相当耗时、费力、昂贵等缺点[20]。

④ 荧光原位杂交技术(FISH)。荧光原位杂交（fluorescencein situhybridization），简称FISH。1988年，Giovannoni等[21]首次将ISH（原位杂交技术）引入细菌学研究，使用放射性标记rRNA寡聚核苷酸探针检测微生物。FISH最常用的靶序列是16S rRNA，根据rRNA目标区域可设计寡聚核苷酸探针，进行种属特异性分析。Schulz等[22]利用FISH技术检测到了巨大的纳米比亚硫酸盐细菌，直径0.5mm。FISH技术也可以与其它仪器或技术联用从而快速方便获得试验结果，如结合流式细胞仪可以检测分析小鼠肠道中微生物的类别和数量，此方法适用于对有关微生物群落进行快速和频繁检测，而且自动化操作水平高。王瑾等[23]运用此方法发现小鼠粪便中厌氧菌、球形梭菌属、肠杆菌、拟杆菌属的数量变化效果明显。

⑤ PCR技术。聚合酶链式反应(PCR)由Mullis等首创于1985年，它的出现被誉为分子生物学发展史上的里程碑。聚合酶链式反应通常与变性梯度凝胶电泳(DGGE)、肠道细菌基因间重复序列(ERIC)等技术联用，并且取得了很好的效果。ERIC-PCR，是利用ERIC序列在不同细菌间的分布和拷贝数不同，通过扩增细菌ERIC相关序列的扩增产物在电泳图谱上呈现独特的位置和其序列分析，达到鉴别细菌属种株的目的。1999年，Giovanni等将ERIC-PCR方法应用于混合菌群的研究，并逐步用于微生物群落的分析[24]。ERIC-PCR能从群落整体或是从功能状态角度反映群落结构的动态变化和变化趋势，并且扩增的条带清晰，数量适中，同一组受试者中高速稳定，对肠道微生态的研究提供了一种可靠的方法。变性梯度凝胶电泳通过凝胶显示DNA片段迁移，已成为一种常用的16S rRNA指纹图谱，其样品可直接进行多样性分析而不需要微生物培养，能检测到体外培养困难甚至不能培养的细菌，1%左右[25]的细菌种群即可通过PCR-DGGE检测到。PCR-DGGE技术研究重组人溶菌酶对小鼠肠道菌群结构的影响中发现一种不可培养的未知菌厚壁菌门细菌[26]。尽管PCR-DGGE技术是研究菌群多样性和结构特征的常规技术，但它需要特殊的仪器设备且操作严格，只能鉴定群落成员和短片段分析，有时会形成双链或异源分子且电泳影响因素多，影响结果。实时PCR拥有高分辨率，但是很少用于复合菌群量化[27]，而rep-PCR具有快速灵敏可重复和可靠性，在分子微生态学研究中有广阔的应用前景[28]。

⑥ 宏基因组技术应用。近年来基因组学技术日臻成熟为微生物学研究提供了新的研究方法和机遇。宏基因组(Metagenome)这一术语由Handelsman等1998年提出的[29]，其定义为环境中全部微小生物遗传物质的总和。宏基因组学（Metagenomics）是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法[30]。以前要想对肠道微生物进行分析，就必须侵入到动物肠道收集微生物样本，这种方法难度高且成本大；随着技术发展，现在只要通过采集动物的粪便或肠道内容物，就可进行肠道菌群基因组的研究。它避免了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识和开发利用未培养微生物，并从群落水平上完整地认识微生物提供了可能。第一个全基因组测序的乙型流感为细菌基因组测序开了一扇窗，现在有超过700个细菌基因组测序已经完成或者正在测序[31]。基因组学时代的到来，使得整个基因组测序越过生物学的技术壁垒，实现在基因组转录，转化水平定量生物分析[32]。

宏基因组学技术一般包括样品总DNA的提取、与载体连接和克隆到宿主中，最后进行文库分析与筛选。目前获得肠道菌群总DNA主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及商业试剂盒等。郭海勇等研究了三种DNA方法，确定CTAB-SDS 法效果最好，提取的基因组 DNA 可用于后续实验PCR扩增的模板，能保证研究结果的可靠性，且该方法不需要特殊的仪器设备，成本低廉，操作简便[33]。寻找和开发更适合表达载体以及如何高效、高灵敏度地筛选活性克隆子是应用该技术的关键问题。载体一般分为克隆载体、表达载体和穿梭载体，一般选择克隆载体，其中质粒是最常用的载体。转化稳定性、转化效率、宏基因的表达量、目标性状等是选择宿主需要考虑的因素，大肠杆菌是最常用的宿主。宏基因组文库既包含可培养的又包含未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间[34]。基因组文库筛选主要有四种方法：功能筛选、序列筛选、底物诱导基因表达筛选和化合物结构水平筛选。经过筛选，使得新基因活性产物表达。

近年来，依靠宏基因组学技术发现了一些传统培养法研究未发现的新种类，促进了对复杂微生态系统的认识。Walter等[35]对小鼠大肠微生物群构建了宏基因组文库，并对表达β-葡聚糖酶活性的克隆进行了筛选，发现2个克隆是来自不可培养的微生物。Ley等[36-37]对小鼠肠道中5 088个rRNA序列分析发现，有64%的序列是未知的属，只有7%是已知可培养的，再对11 831个健康成年人结肠粘膜和粪便里分离的细菌16S rRNA，发现九个分枝，60%~80%的序列是厚壁菌门，20%~40%是拟杆菌门。Manichanh等[38]利用宏基因组方法研究发现阶段性回肠炎患者肠道微生物多样性大大降低，尤其是硬壁菌门的细菌种类大大减少。Shedova等[39]在人体肠道中发现了一种叫做多形拟杆菌新种5482(Bacteriodes thetaiotaomicronVPI-5482)，它是革兰氏阴性菌厌氧细菌，有净化肠道的功能。聂志强等[40]采用宏基因组学技术研究发现醋酸发酵过程中乳酸菌和醋酸菌是优势菌群。

采用宏基因组技术，可直接研究微生物群体中某特定微生物基因组的结构与功能，摆脱了传统微生物学研究对纯培养的依赖，使未培养微生物的认识和开发成为可能[41]。它提供了一种探知微生物多样性结构和功能基因组的方法，是一条寻找新基因产物的新途径。

3 展 望

在过去20余年间，由于克服了传统的微生物纯培养的限制，一些不依赖传统培养的研究技术发展改变了人们对自然界微生物多样性的认识。自然界有超过99%的微生物目前无法在实验室中进行培养，所以找到一种方法来描述、接近和利用这些未培养的微生物是微生物研究的方向。在抗生素污染问题越来越严重的今天，过多药物的应用造成肠道菌群平衡紊乱，使一些非致病菌死亡，肠道菌群平衡失调，从而引起长期腹泻或者缺乏维生素等反应，造成人体伤害，有益的芽孢杆菌的应用，是解决抗生素问题的一个有效方案。随着分子生物学的发展，益生菌将会开发成为一种理想的肠道菌群调节剂，以促进食品工业的发展和人民群众的健康。肠道菌群研究方法的进步，尤其是宏基因组的应用，大大的避开了微生物分离培养的问题，极大扩展了微生物的资源利用空间，增加了获得新生物活性物质的机会，因此宏基因组学的应用将是未来科学研究的趋势。肠道菌群的研究对于弄清益生菌影响肠道功能的作用方式、作用机理是非常有用的，相信随着技术水平的进一步提升，将会更趋向高速化、精确化、灵敏化。

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