水稻强弱势粒24-nt siRNA表达量与DNA甲基化的关系研究

刘燕霞， 彭 廷， 赵亚帆， 杜彦修， 张 静， 李俊周， 赵全志， 孙红正

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

DNA甲基化是表观遗传学的一种重要形式，在维护基因组稳定性、调节基因表达、调控植物发育等方面具有重要作用[1～3].24-nt siRNA是植物中数量最多的小RNA，能在基因转录后水平或转录水平分别通过切割靶基因和介导DNA甲基化来调控基因表达，从而调节植物的生长调节.目前，多数研究认为，24-nt siRNA主要参与RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)[4～6]，因此,研究24-nt siRNA表达量与DNA甲基化之间的关系，对基因表达差异形成的原因探讨具有重要的指导作用.MORITOH等[2]通过研究水稻中参与DNA甲基化的甲基化酶OSDRM2突变体，发现DNA甲基化水平降低，且参与指导DNA甲基化的siRNA(small interfering RNA，siRNA)表达量也有所降低.GROSZMANN等[7]认为,24-nt siRNA水平降低与DNA甲基化和基因表达变化有关，并对杂种优势有作用.通过对大穗型水稻品种新丰2号灌浆过程中5个时期的小RNA进行测序，发现随着灌浆的持续，强弱势粒中24-nt siRNA的表达量逐渐降低，而且在各个时期弱势粒中24-nt siRNA的表达量都高于强势粒[8].目前,关于水稻子粒灌浆过程中强弱势粒间有差异表达的24-nt siRNA能否引起靶基因甲基化差异的研究未见报道.为了探讨强弱势粒24nt-siRNA表达量与靶基因DNA甲基化之间的关系，本研究采用亚硫酸盐测序法检测了强弱势粒中产生大量24-nt siRNAs的靶基因甲基化状态，分析DNA甲基化差异，并对强弱势粒24-nt siRNA与DNA甲基化之间的关系进行讨论.

1 材料与方法

1.1材料

以黄淮流域大面积推广的大穗型粳稻新丰2号为材料，2012-06-18种植于河南农业大学科教园区.抽穗开花期选取生长整齐，株型一致，同1 d开花的主穗挂牌标记.取花后10 d的小穗，按PENG等[9]的方法分离强弱势粒，液氮速冻后，于-80 ℃保存.

1.2方法

1.2.1 水稻强弱势粒24-nt siRNA实时荧光定量PCR验证 按microRNA实时定量茎环RT-PCR原理[10]，设计3对24-nt siRNA引物(表1).新丰2号花后10 d强弱势粒总RNA的提取用RNA提取试剂盒(TransGen Biotech，Tranzol Plant,ET1201-01)进行，然后使用HiFi-MMLV cDNA Kit(康为世纪，CW0744A)反转录成cDNA. 取5 μL按1∶20稀释的cDNA做模板，配置20 μL含有10 μL UltraSYBR mixture反应体系，以β-actin为内参基因，在BioRad Iq5仪器上进行实时荧光定量PCR，反应程序：95 ℃预保温10 min ，95 ℃变性30 s ，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环.所有PCR均设置3次重复，24-nt siRNA相对表达量用2-△△Ct方法计算[11].

表1 实时荧光定量qRT-PCR和DNA甲基化检测引物序列

1.2.2 亚硫酸盐测序法检测DNA甲基化状态 水稻子粒基因组DNA提取使用基因组提取试剂盒(康为世纪，CW2298)，提取的基因组DNA用甲基化DNA检测试剂盒(康为世纪，CW2140)进行重亚硫酸氢盐处理[12，13].以甲基化处理后的DNA做模板，分别用引物BSP-1F/BSP-1R和BSP-2F/BSP-2R进行巢式PCR扩增，引物序列见表1.反应结束后用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用DNA产物纯化试剂盒(康为世纪，CW0520)回收PCR产物.回收的PCR产物分别进行TA克隆，转化感受态细胞DH5α，随机挑取15个克隆进行测序.

1.2.3 CyMATE在线软件分析DNA甲基化水平 植物DNA甲基化有3类：对称性CG,CHG和非对称CHH(H表示A，T或C)[2].采用HETZL等[14]提出的CyMATE在线软件(http://www.cymate.org/)分析法分别得到每个克隆的3类胞嘧啶甲基化水平，每个克隆总胞嘧啶甲基化比例为每个克隆3类胞嘧啶甲基化比例之和.以1个克隆作为1次重复，用Excel软件统计靶基因区域胞嘧啶整体甲基化水平(总胞嘧啶甲基化比例)和3类胞嘧啶甲基化水平.

2 结果与分析

2.1水稻强弱势粒24-ntsiRNA实时荧光定量验证

大规模小RNA测序数据结果表明，新丰2号基因组第12条染色体的1个DNA区段产生大量24-nt siRNA (图1).从中选取3个高表达的24-nt siRNA(siR138309，siR326225，siR95400)，用qRT-PCR方法检测花后10 d在强弱势粒中的表达水平.结果显示,3个24-nt siRNA的相对表达量在强弱势粒间存在差异，且在弱势粒中的表达量都高于强势粒，与测序结果一致(图2).

2.2水稻24-ntsiRNA靶基因甲基化状态及差异分析

选定的24-nt siRNA靶基因区段核苷酸长度为330 bp，以重亚硫酸氢盐后的水稻强弱势粒基因组DNA为模板，采用巢式PCR方法均扩增出330 bp的条带，与预期结果一致.通过克隆测序检测强弱势粒中24-nt siRNA靶基因区段胞嘧啶甲基化状态，用CyMATE在线软件输出靶基因甲基化状态(图3).

图1 10个表达量高的24-nt siRNAs在第1外显子上的分布

图中黑色长方框为第1外显子，方框左右的短线分别代表非编码区和内含子区.siR138309等10个siRNAs是10个表达量高的24-nt siRNAs. siR138309下方黑色短方框在黑色长方框上对应的位置代表siR138309靶基因在第1外显子上的分布.

The long black box in the figure represents the first exon region and the single line on the left and right sides of the long black box represents non-coding region and intron region respectively. Ten siRNAs for example siR138309 are ten high expression 24-nt siRNAs. The position of black long box opposited to the short black box below siR138309, show the distribution of siR138309 target genes on the fist exon region.

图2 24-nt siRNAs大规模测序丰度(A)和24-nt siRNAs实时荧光定量qRT-PCR验证(B)

图3 水稻强弱势粒DNA甲基化示意图

实心图表示胞嘧啶发生甲基化;空心图则表示胞嘧啶未发生甲基化;圆形为CG二核苷酸;方形为CNG三核苷酸;三角形为CHH三核苷酸.S为强势粒，共有11个克隆;I为弱势粒，共14个克隆.图中position对应的数字表示目标片段中胞嘧啶所在的位置.

The filled symbols represent cytosine methylation and empty symbols represent unmethylated cytosine. The circles indicate CG, squares for CHG and triangles for CHH. S represent superior grains, and S-1—S-11 represent 11 clones sequenced. I is for inferior grains, and I-1—I-14 for 14 clones sequenced. The numbers at the bottom of the figure indicates the nucleotide position of the cytosine methylation along the sequence alignment.

本试验中亚硫酸盐测序检测的24-nt siRNA靶基因为LOC_Os12g40000的第1个外显子(209 bp)，共含有80个胞嘧啶，其中CG类型的胞嘧啶25个，占总胞嘧啶的31.25%，CNG类型的胞嘧啶21个，占总胞嘧啶的26.25%，而CHH类型的胞嘧啶有34个，占总胞嘧啶的42.50%.靶基因总胞嘧啶甲基化水平在强弱势粒间存在显著差异(P<0.05)，强势粒总胞嘧啶甲基化水平可达到82.84%，弱势粒只有64.02%，强势粒靶基因甲基化水平高于弱势粒.CG类二核苷酸胞嘧啶甲基化水平在强弱势粒间虽然都高达98%，但没有差异.组成总胞嘧啶的2类CHG和CHH三核苷酸胞嘧啶甲基化水平在强势粒中均高于弱势粒，且CHH差异显著(P<0.05)(图4).由于CHG和CHH类胞嘧啶占靶基因总胞嘧啶的72.5%，由此推测，强弱势粒间CHG和CHH类甲基化差异可能是造成强弱势粒靶基因甲基化水平差异的主要原因.

3 结论与讨论

水稻基因组中大多数CG群与基因有关，而基因与基因之间的甲基化水平差异很小[15].作者检测到了水稻花后10 d种子发育中CG，CHG和CHH的3类DNA甲基化状态.对强弱势粒间3类DNA甲基化水平分析发现，强弱势粒中CG类甲基化水平都高但不存在差异，而强势粒中CHG和CHH类甲基化水平都高于弱势粒，最终导致强势粒整体甲基化水平高于弱势粒.因此，水稻强弱势粒间高程度的CG甲基化可能是基因存在的标志，而强弱势粒间CHG和CHH甲基化差异可能是在种子发育过程中形成的.

图4 水稻强弱势粒间靶基因总胞嘧啶甲基化水平及3类胞嘧啶甲基化水平

24-nt siRNAs能够通过RdDM途径指导序列特异性DNA甲基化和组蛋白修饰[16].通过对新丰2号花后5个时期的测序发现，24-nt siRNA在弱势粒的每个时期的表达量都非常高[8].根据目前的研究认为，相对于强势粒，弱势粒中表达量较高的24-nt siRNA将会导致较高水平的DNA甲基化[3～5].本试验选取了产生大量24-nt siRNAs的DNA片段，对其胞嘧啶甲基化水平进行亚硫酸盐测序分析，结果表明，强势粒中表达量较低的24-nt siRNA，其靶基因甲基化水平比弱势粒高.

出现这种情况的一个可能原因是强弱势粒间24-nt siRNA的差异是DNA甲基化造成的.有证据表明，转录起始位点下游的DNA甲基化，特别是第1个外显子的甲基化会导致基因转录水平的沉默[17].24-nt siRNA的产生首先需要pol IV转录出单链RNA，单链RNA在RDR2作用下合成互补链形成双链RNA，最后双链RNA由DCL3切割成为24-nt siRNA[18～21].转录水平的沉默会造成24-nt siRNA产生源头减少，最终导致24-nt siRNA表达量降低.本试验研究的24-nt siRNA靶基因区域为第1外显子，强势粒第1外显子较高的甲基化水平，可能导致了基因转录的高度抑制，进而引起强势粒产生较少的24-nt siRNA弱势粒，反之亦然.因此，弱势粒24-nt siRNA表达量高可能是甲基化水平低造成的结果.

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