植物源有机物料对果园土壤微生物群落多样性的影响

程存刚， 赵德英， 吕德国， 姜 曼， 杜国栋

(1 沈阳农业大学园艺学院， 辽宁沈阳 110866； 2 中国农业科学院果树研究所， 辽宁兴城 125100)

土壤微生物是土壤生态系统中极其重要和最活跃的部分，是驱动土壤有机物质和养分转化、 循环的主要动力[1]。微生物的群落多样性在很大程度上反映了土壤有机碳库的转化情况[2-3]。研究表明，植物凋落物、 根系残体、 外源有机物投入的种类和存在状态的差异会改变土壤微生物生长所需能量物质的数量和质量，进而影响土壤微生物数量、 群落结构及活性[4]。Degens[5]已证明向土壤中添加简单有机物可改变土壤微生物的代谢特征和代谢多样性。

目前测定土壤微生物多样性的方法很多，从最常规的稀释平板法到微生物量测定、 磷脂脂肪酸分析法、 BIOLOG 微平板分析法到分子生物技术方法等。以Biolog微孔板碳源利用为基础的定量分析为描述微生物群落功能多样性提供了一种更为简单、 快速的方法，已在评价不同类型土壤微生物的群落功能方面被广泛应用[6]。

由于苹果园大多数分布在缓坡丘陵地，土壤有机质含量低，特别是连年大量施用化肥和农药以及一些不合理的土壤管理措施，导致土壤肥力持续下降，特别是氮、 磷严重流失、 土壤酸化，不仅产生了较大的环境风险，而且妨碍树体对营养元素的吸收，降低了果实品质，严重地制约着苹果产业的健康发展[7-8]。有机肥料在保持、 改善和提高土壤肥力， 活化土壤养分， 增强土壤酶活性方面有着不可替代的作用[9]。禽畜废弃物是传统有机肥的主要来源，但近年来动物源有机肥严重不足，传统的施肥方式费时费工，同时施用禽畜废弃物在重金属、 盐胁迫及病原物危害等方面存在风险[10-11]。因此如何合理利用有机肥，充分发挥其在培肥地力方面的作用，已成为生产中亟待解决的重要问题。随着果树有机化栽培的开展，生产者越来越重视通过施用植物源有机肥来改善果园土壤状况，进而提高果品的产量与品质[12]。研究表明，葡萄糖、 尿素等小分子有机物以及土壤动物如蚯蚓在加快植物源有机物料在土壤中的腐解与转化方面发挥着重要作用[13-15]。由于前人的研究主要集中在有机物料对土壤理化性状、 微生物量、 酶活性的影响等方面[16-18]，而在有机物料对土壤微生物群落多样性的影响，特别是有机物料腐殖化过程中驱动因子作用方面的报道较少，本试验研究了苹果枝条、 秸秆和杂草覆盖后果园土壤微生物群落多样性的差异，旨在探求葡萄糖、 尿素等小分子有机物和蚯蚓在植物源有机物料向土壤碳库转化中的作用，为揭示果园土壤质量的演变机制，实现果园内部的物质能量循环提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2011年4月至2012年11月在沈阳农业大学果树试验基地(41°83′ N，123°56′E)进行。供试土壤取自中国农业科学院果树研究所砬山试验基地苹果园0—20 cm土层，采样园面积为4.3 hm2，土壤质地为砂壤土，母质主要为花岗片麻岩风化物。采用Z形五点取样法。试验地为缓坡地(坡度<5°)，土壤肥力和管理水平一致。试验前果园0—20 cm土壤有机质含量为19.9 g/kg、 碱解氮122.79 mg/kg、 速效磷6.08 mg/kg、 速效钾219.83 mg/kg(于2011年4月30日测定)。3种植物源有机物(苹果枝条、 玉米秸秆和果园杂草)采用FZFS665Y型移动式枝桠粉碎机粉碎，将通过1.70 mm筛的土壤和3种有机粉碎物分别以质量比为30 ∶1的比例混合均匀，作为盆栽基质。

盆栽基质中栽植生长势整齐一致的2a生苹果砧木山定子幼苗，栽植容器为21cm×21cm的黑色聚乙烯营养钵，每个营养钵内装3.0 kg基质，每种基质栽植45盆。

1.2 试验设计

盆栽试验采用L9(34) 正交试验设计(见表1)，于2011和2012年6月1日进行小分子有机物和蚯蚓的添加，小分子有机物均以水溶液的形式进行浇灌，以达到土壤饱和含水量为准，并以托盘放于盆底，回收外渗溶液。尿素、 葡萄糖用量为4.0 g/pot。试验用蚯蚓为太平2号Eiseniafoetida(Savigny)成年蚓，于添加前1d对蚯蚓进行24 h的饥饿处理，选择大小一致的蚯蚓放入盆中，按试验设计每盆放0 条、 6条和12条，各处理重复15次。

于处理后第20 d取样，采用破坏性取样方法。将黑色营养钵褪掉，松动土团，提出植株，抖动植株根系，将土壤混合均匀，过0.85 mm筛，于4 ℃条件下保存，用于土壤微生物群落多样性分析。

表1 正交试验设计

1.3 试验方法

土壤微生物功能多样性采用 BIOLOG生态测试板( EcoPlatesTM，美国Matrix Technologies Corporation生产)测定。称取相当于10 g烘干土重的新鲜土样，加入到盛有90 mL 0.85% NaCl无菌溶液的三角瓶中，封口后在摇床上震荡(200 r/min)30 min，按10倍稀释法用0.85% NaCl无菌溶液将其稀释至原来的10-3用于接种。接种量为150 μL，每样1板，3次重复，将接种好的测试版加盖置于25 ℃暗箱培养，连续培养192 h，期间每隔 24 h用BIOLOG读数仪在590 nm下读数[19]。

Biolog Eco Plate微孔板的总体颜色变化用平均孔颜色变化率(AWCD，average well color development)表示。AWCD=∑(Ci-R)/31，其中Ci为各反应孔在590 nm下的吸光值，R为对照孔的吸光值，Ci-R<0的孔在计算中记为0[20]。本研究取培养96 h时微平板光密度值进行多样性指数计算、 主成分分析[19]。微生物群落功能多样性的计算，包括:

丰富度(Richness)指数S，指被微生物群落利用的基质的数量。微孔的光密度值≥0.25，则认为是阳性值并计入微生物群落的丰富度 S (即此类微孔的总和)；

多样性指数(Diversity)H H =-∑Pi×lnPi，式中， Pi= (Ci-R)/∑(Ci-R)，表示反应孔与对照孔光密度值之差和整块板总差的比值；

均匀度(Evenness)指数 E， E =H/lnS；

优势度(Simpson)指数Ds，Ds=1-∑Pi2，用于评估某些最常见种的优势度。

1.4 统计分析

试验数据采用DPS 7.05数据处理软件进行处理，用Duncan′s 多重比较法(P<0.05)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 培养过程中AWCD值的变化

图1 不同处理微生物的平均颜色变化率Fig.1 AWCD of soil microbial process under different treatments

2.2 土壤微生物群落多样性指数分析

微生物群落功能多样性是反映其群落状态与功能结构的指标。从表2可以看出，不同处理微生物功能多样性不同。培养96 h后，微生物的平均颜色变化率(AWCD)和优势度指数(Ds)以T4最大，丰富度指数(S)以T2最大，而多样性指数(H)和均一度指数(E)各处理差异不显著。 小分子有机物种类对S指数(F2=5.83)和DS指数(F2=5.32)的影响显著，而有机物种类和蚯蚓数量对S指数和DS指数的影响不显著； 有机物种类、 小分子有机物种类及蚯蚓数量均对H、E指数的影响不显著。

表2 土壤微生物群落多样性指数和96 h AWCD

图2 盆栽试验不同处理微生物对六类碳源的利用Fig.2 Utilization of 6 groups of C sources by soil microbial community of different treatments in the pot culture

2.3 微生物利用碳源情况的分析

土壤微生物对不同碳源的利用反映了微生物的代谢功能类群。根据BIOLOG-ECO板的碳源类型，将其31种碳源分为碳水化合物类、 氨基酸类、 羧酸类、 多聚物类、 芳香族类、 胺类6类，观察不同处理微生物利用碳源的吸光值变化。

如图2所示，各处理土壤微生物对各类碳源的利用率均有所提高。碳水化合物种类各处理间差异显著，表现为T4>T6>T3、 T2>T1>T8>T9>T7>T5，由主体间效应检验看出，有机物料种类、 小分子有机物、 蚯蚓数量3个因素均对碳水化合物类碳源影响显著，表现为F2=99.28>F3=90.04>F1=75.61； 氨基酸类的AWCD值表现为T4>T6、 T7、 T3>T5、 T2>T8、 T1>T9，3个因素均对氨基酸类AWCD值的影响显著，且以蚯蚓数量与有机物料种类影响较为显著，表现为F3=128.65>F1=111.43>F2=20.19； 羧酸类AWCD值表现为T5>T4>T3>T7、 T2>T8>T6、 T9>T1，表明3个因素均对羧酸类AWCD值的影响显著，且以小分子有机物种类的影响最为显著，表现为F2=1786.13>F1=1028.95>F3=722.96； 多聚物类的AWCD值表现为T4、 T1、 T2>T3>T6>T8、 T9>T7>T5，显示3个因素均对多聚物类AWCD值的有显著影响，且有机物料种类的影响最显著，表现为F1=1370.78>F2=1035.46>F3=574.86； 芳香族类AWCD的值表现为T3>T8>T6>T9>T1>T7、 T5>T4、 T2，说明3个因素均对芳香类AWCD值的影响显著，表现为F2=86.40>F1=28.35>F3=23.01； 胺类AWCD值表现为T1>T2、 T4>T7>T9、 T3>T8>T5>T6，3个因素均对胺类AWCD值也有显著影响，且以有机物料种类影响最为显著，表现为F1=324.36>F2=170.08>F3=8.57。

2.4 微生物群落主成分分析

土壤微生物多样性反映了群落总体的变化，但未能反映微生物群落代谢的详细信息，研究土壤微生物对不同碳源利用能力的差异，有助于更全面地了解微生物群落代谢功能特性[22]。从表3可以看出，以培养96 h时不同处理微生物对微孔板上31种碳源利用情况做PCA分析，31个成分因子中前5个的累计方差贡献率达到84.03%，从中提取可以聚集单一碳源变量的数据变异的前2个主成分PC1和PC2(它们的累计方差贡献率为48.37%，特征根分别为10.11和4.88)来分析土壤微生物功能多样性。

表3 主成分的特征根

图3 不同处理微生物群落碳源利用主成分分析Fig.3 PCA of carbon utilization of the soil microbial community

图3显示，不同处理对微生物利用碳源的分异情况差异显著。第1主成分(PC1)聚集了42.15%的数据变异，第2主成分(PC2)聚集了 16.15%的数据变异，两主成分基本能够反映土壤微生物群落碳源利用情况的主要信息。PC1轴T2、 T4主要分布在正方向，T5、 T7、 T8主要分布在负方向，表明小分子有机物葡萄糖、 尿素以及蚯蚓数量是影响土壤微生物对碳源利用能力差异的主要因素。

由表4可以看出，对PC1贡献大(特征向量≥0.20)的碳源有12种，碳水化合物类占6种，多聚物类和胺类各占2种，氨基酸类和羧酸类各占1种。对PC2贡献大的碳源有11种，碳水化合物类占4种，多聚物类和芳香类各占2种，氨基酸类、 羧酸类和胺类各占1种。从中可以看出，对PC1和PC2起分异作用的主要碳源分别是碳水化合物类和多聚物类。

3 讨论与结论

微生物利用有机物质作为能源，其生命活动可以加速有机物的分解和营养元素在土壤生态系统中的循环[23]。有机物料作为外源有机碳源输入土壤中，会对土壤有机碳库的转化产生影响。前人曾利用不同的有机物料在不同的土壤和生态体系中，对植物残体的分解、养分的释放以及土壤生物的作用等方面作过不少的研究[24-25]。

表4 对PC1和PC2贡献的特征向量绝对值≥0.20的碳源

作为外源有机物的农业生产废弃物的枝条、 秸秆和杂草进入土壤后都是较难分解的有机物，不利于微生物快速繁殖利用。有机物的组分不同，分解难易就不同，其腐殖化产物的质量和性质也不同[26-27]。李云乐等[28]研究发现，在有机物分解初期，土壤微生物能比较快地迁移到秸秆表面，秸秆表面的生物数量最多的是细菌，随着细菌的数量增加，有机物分解速度加快。而有机物分解后期，细菌的数量逐渐减少，有机物的分解速度逐渐减慢[29]。本研究结果表明，有机物料的种类对于微生物种群结构的影响差异显著，表现为在枝条处理中微生物的功能多样性较强，杂草较枝条更易分解，秸秆处于枝条和杂草处理之间，但由于秸秆的含氮量相对更高，微生物的功能多样性相对较强，等质量的枝条、 秸秆和杂草处理后，枝条处理的微生物多样性增加最显著。

葡萄糖、 尿素作为微生物的碳源和氮源物质，进入土壤后迅速为微生物所利用，增加了微生物数量，快速增长的微生物群落，促进了外源有机物料碳向土壤碳库的转化，微生物的功能多样性也显著增强[13-14,30]。于跃跃和赵炳梓[31]的研究表明，添加葡萄糖可显著提升土壤微生物活性，其中在纤维素存在的基础上以无机氮与葡萄糖共同添加的提升效果最为显著。本试验中，加入葡萄糖小分子有机物，可为土壤微生物提供可迅速利用的碳源，微生物大量繁殖，加快了添加的外源枝条、 秸秆和杂草分解的速度； 而尿素的加入，为微生物的生长提供了氮源，但单独添加尿素对微生物的功能活性影响不大。

蚯蚓作为陆地生态系统中重要的大型土壤动物，能明显促使植物残体进入土壤，加快植物残体在土壤中的分解与转化[15]。土壤中接种蚯蚓对土壤微生物群落组成及活性产生深刻影响[32]。土壤微生物群落特性变化受蚯蚓作用和土壤类型及植物残体间交互作用的影响[33-34]。本试验研究表明，蚯蚓活动对微生物功能多样性的影响较葡萄糖的影响效果小，但蚯蚓取食有机物料，分泌各种水解酶，通过有机质的再分布与加工过程直接或间接影响微生物的组成、 丰富度和活性，并通过蚯蚓粪内微生物的富集并释放到土壤中而增加特定类群土壤微生物数量，突出了优势作用微生物在土壤中的分配。

微生物功能多样性能够反映土壤质量指标信息，可看作是评价土壤质量变化的敏感参数。植物源有机物及外源驱动因子的加入，一方面由于土壤环境的改变，本身会影响微生物的群落结构和功能，另一方面使土壤中养分的转化发生了明显的改变，从而影响微生物的代谢活性。BIOLOG 测试系统是快速测定土壤微生物群落功能代谢多样性的一种潜在有效手段，但由于果园土壤微生物具有独特的生理类型，使得果园土壤具有独特的微生物多样性，因此，在应用BIOLOG 测试系统鉴定微生物群落的潜在功能多样性时, 应进一步研究产生其代谢的土壤剖面差异的微生物种类，将碳源利用速率与根际环境中实际存在的碳源有效性联系起来，以完善该技术在果园土壤环境研究中的应用。

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