磷转运蛋白基因TaPht1;4的染色体定位及其在低磷下与小麦吸磷能力的关系

郭 丽, 郭程瑾, 路文静, 李小娟, 肖 凯*

(1 河北农业大学农学院， 河北保定 071001； 2 河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001)

磷易被吸附、 固定的特性导致作物对磷素资源的利用效率较低[1]。磷素作为不可再生资源，世界范围内用于生产磷肥的磷矿石资源日益枯竭[2]。利用植物在吸收和利用磷素资源上表现的遗传多样性特征，提高作物抵御低磷逆境能力，对于促进磷素资源的可持续利用具有重要实践意义。

研究表明，作物根系存在两个磷素吸收运载系统，其中一个系统对介质中磷素具有高亲和特性(Km值变化在3至7 μmol/L)，主要参与对低浓度无机磷(Pi)供应水平下介质中的磷素吸收[1]； 另一个系统对介质中磷素具有低亲和特性(Km变化在50至330 μmol/L)，主要参与高浓度Pi供应水平下介质中的磷素吸收以及植株中Pi在细胞、 组织间的转运[2-3]。研究证实，位于根系表皮和根毛细胞质膜上的高亲和磷转运蛋白(PT)和位于植株中各器官、 组织细胞质膜的PT，分别是上述高、 低亲和磷素吸收运载系统的重要组分[1,3 ]。迄今，在拟南芥和水稻等不同植物种属中已鉴定了许多PT基因，并对上述基因分子特征及介导磷素吸收和转运的生物学功能及其机理进行了深入研究[4-8]。

小麦是我国重要粮食作物，提高小麦的磷素利用效率对于保障我国粮食安全和促进农业可持续发展具有重要现实意义。迄今，尽管有关小麦磷素吸收、 利用的遗传学差异、 生理生化机制和小麦基因型(品种)的磷效率鉴定评价指标已开展较多研究[9-11]，但有关小麦PT基因的鉴定、 分子特征分析和功能解析研究与拟南芥和水稻相比仍较少。前期工作中，作者对1个归属于高亲和家族的小麦PT基因TaPht1; 4进行了克隆和功能分析，发现该基因在介导植株低磷逆境下的磷素吸收中发挥着重要作用[8]。本研究以中国春遗传背景的整套B染色体双端体为材料，对TaPht1; 4的染色体定位特征以及该小麦磷转运蛋白基因与低磷下不同磷利用效率小麦品种磷效率的联系进行了研究，旨在为今后小麦品种及资源的磷效率分子鉴定和耐低磷小麦磷高效遗传改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 TaPht1; 4在染色体上定位鉴定分析

参照郭程瑾等(2011)的方法[12]，水培CS及整套B染色体组双端体材料。三叶期时，收获各供试材料根系。采用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa)提取各材料基因组DNA。以各材料基因组DNA为模板，采用TaPht1; 4特异引物，进行目标基因扩增。扩增TaPht1; 4的引物为5′-TTCACGACCTGGCCTGC (正向)和5′-TTACAAAATTTCCACGCTGT(反向)[8]。PCR扩增条件为95℃ 4 min，随后进行28个下述循环: 95℃ 1 min，55℃ 40 s，72℃ 1 min。通过对PCR扩增产物进行电泳检测，进一步对扩增产物克隆和测序鉴定，阐明TaPht1; 4在染色体上的定位。

1.3 供试材料TaPht1; 4的表达分析

参照上述培养方法[12]，水培CS、 整套B染色体组双端体和不同磷素吸收效率品种至三叶期。然后转入低磷胁迫(20 μmol/L Pi)进行48 h处理。期间，在处理后24 h收获根叶样本，以低磷处理前的根、 叶作对照。采用Liu等(2013)的方法[8]，进行样本总RNA提取、 RNA反转录和TaPht1; 4的半定量RT-PCR及实时定量PCR(qPCR)分析。 其中，以在小麦中呈组成型表达的微管蛋白基因(tubulin)作为上述各样本分析中TaPht1; 4转录本均一化内标。扩增tubulin的正向引物为5′-CATGCTATCCCTCGTCTCGACCT， 正向引物为5′-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT。

1.4 供试材料的单株干物重和磷吸收参数分析

选择各供试材料均匀的种子，萌发后分别转入正常供磷(MS营养液，1.2 mmol/L Pi)和低磷胁迫(调整含磷后的MS， 50 μmol/L Pi)2种处理下水培，具体参照郭程瑾等的方法[12]进行。处理3周后，选取代表性幼苗，参照Guo等的方法[13]进行单株干重和全磷含量测定。以单株干重和全磷含量的乘积计算出单株磷累积量，通过单株干重除以单株磷累积量求得磷效率。

1.5 统计学分析

本研究中PCR扩增、 半定量RT-PCR和1PCR分析以及植株干重和磷吸收参数测定均进行3次重复。采用SAS统计学分析软件，对丰、 缺磷条件下供试材料的单株干重、 磷效率参数和qPCR中基因表达水平进行平均值计算、 标准差分析和统计学上的显著性测定分析。

2 结果与分析

2.1 磷转运蛋白基因TaPht1; 4在染色体臂上的定位

以中国春(CS)和分别缺少该品种B染色体组各长、 短臂的整套双端体为材料，采用PCR技术，对高亲和磷转运蛋白基因TaPht1; 4的染色体定位特征进行了研究。结果表明，与CS及其他双端体材料能特异扩增目标基因的结果不同，在3BS中未扩增到目标基因(图1A)。采用半定量RT-PCR和qPCR对丰、 缺磷条件下CS和各双端体根、 叶中TaPht1; 4的表达进行了检测。结果显示，丰磷条件下，各供试材料根、 叶片中均检测不到TaPht1; 4的表达(资料未列出)； 缺磷条件下，各供试材料叶片中也均未检测到TaPht1; 4的表达，但在根系中除3BS未检测到TaPht1; 4表达外，CS和其他双端体均具有较高的TaPht1; 4表达水平(图1B，图1C)。因此说明，TaPht1; 4定位在3B染色体长臂，呈低磷诱导和根系特异表达特征，该表达特征与先前的研究结果[8]一致。

图1 TaPht1; 4在CS及其B染色体组双端体的PCR扩增和表达水平检测Fig.1 PCR amplification and expression level of TaPht1; 4 in CS and its ditelosimic lines of B chromosome

2.2 丰、 缺磷条件下丧失TaPht1; 4基因3BS和中国春的干物质积累特征

丰磷条件下，3BS单株干重与CS没有差异； 缺磷条件下，与CS相比，3BS单株干重显著降低(图2)。表明缺少TaPht1; 4及所在3B染色体长臂后，植株的干物质生产能力受到较大影响，这可能与由于缺乏该染色体臂丧失TaPht1; 4造成低磷逆境下植株的磷素吸收能力降低具有紧密联系。丧失TaPht1; 4对丰磷条件下的植株干物质生产没有明显影响，可能是由于该小麦PT基因不参与丰磷条件下植株磷素吸收或该条件下植株磷素吸收是由于其他PT成员介导所致。

图2 丰、 缺磷条件下CS和3BS的单株干重Fig.2 The plant dry weight of CS and 3BS under conditions of Pi sufficience and Pi deprivation

2.3 丰、 缺磷条件下丧失TaPht1; 4基因3BS和中国春的全磷含量、 磷累积量和磷效率

与CS相比，丰、 缺磷条件下3BS植株全磷含量以及磷效率均无明显改变(图3)。丰、 缺磷条件下3BS的单株磷累积量与CS相比其表现规律与单株干重相同，表现为丰磷条件下两者无明显差异，但低磷条件下3BS的单株磷累积量较CS显著减少(图3)，表明缺少3B染色体长臂及相应TaPht1; 4后，与CS相比3BS在丰、 缺磷条件下的植株含磷量和磷效率没有变化，但低磷胁迫条件下的植株磷素吸收数量减少。低磷胁迫条件下3BS植株磷吸收量减少可能是其单株干重较CS显著降低的重要原因。

2.4 不同磷效率小麦品种TaPht1; 4的表达特征、 单株干重和磷效率参数特征

以6个低磷下不同磷吸收效率的小麦品种为材料，对丰、 缺磷条件下各小麦品种TaPht1; 4的表达水平以及单株干重、 全磷含量、 磷累积量和磷效率进行了研究。结果表明，丰磷条件下，不同品种根、 叶中均检测不到TaPht1; 4的表达(资料未列出)，各品种间的单株干重、 全磷含量、 磷累积量和磷效率也无明显差异(图4)； 缺磷条件下，不同小麦品种根系中的全磷含量和磷效率也无明显差异，但根系中TaPht1; 4表达水平、 单株干重和单株磷累积量呈现明显的变化规律，表现为随着品种磷吸收效率的提高，TaPht1; 4表达水平随之增高(图5)、 单株干重和单株磷累积量也随之增大(图4)。上述结果表明，低磷胁迫条件下TaPht1; 4的表达水平与小麦品种在低磷逆境下的磷素吸收和干物质积累具有紧密联系。

图3 丰、 缺磷条件下CS和3BS的全磷含量、 单株磷累积量和磷效率Fig.3 Total P content, plant dry weight and P use efficiency of CS and 3BS under Pi sufficiency and Pi deprivation

图4 丰、 缺磷条件下不同磷吸收效率小麦品种的单株干重、 全磷含量、 磷累积量和磷效率Fig.4 The plant dry weight, total P content, accumulative P amount and P use efficiency in wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P sufficiency and P deprivation

图5 缺磷条件下不同磷吸收效率小麦品种根系中TaPht1; 4的表达水平Fig.5 The expression levels of TaPht1; 4in the roots of wheat cultivars with different low-P use efficiencies under P deprivation

3 讨论与结论

磷转运蛋白(PT)在介导植株吸收和转运磷素的过程中发挥重要作用。研究表明，植物根系对生长介质中磷素的吸收以及已吸收至植株体内磷素在组织和细胞间转运，是由位于细胞质膜上的PT介导完成的。期间由H+-ATPase提供驱动H+与Pi共转运的动力[1,14]。基因功能分析发现，部分特定植物种属PT成员，在增强低磷逆境下植株的磷素吸收能力中发挥着重要功能[8,15-18]。

高亲和PT基因具有很强的亲和Pi能力，在表达上多呈根系特异/优势表达且受到外界低磷逆境诱导的特征[1-2,19-22]。上述表达特征及亲和Pi的生化特性，是该类别PT成员构成低磷胁迫条件下根系吸收介质中磷素主体的重要分子基础。作者的前期研究表明，TaPht1; 4是归属于PHT1家族的小麦高亲和PT成员，具有补偿缺失磷素吸收酵母突变体的磷素吸收能力，在增强植株抵御低磷逆境中发挥着重要功能[8]。本研究采用分别仅缺失B染色体组各长、 短臂的整套双端体为材料，利用PCR和基因表达检测技术对TaPht1; 4在染色体上的定位进行了鉴定。表明该小麦高亲和PT基因定位在3B染色体的长臂上。缺失该染色体臂的双端体3BS，低磷胁迫条件下植株的干物质生产能力和单株磷累积量与对照中国春(CS)以及其他B染色体组双端体相比明显下降。表明位于3B染色体长臂的TaPht1; 4，通过对低磷逆境特异应答及表达蛋白对介质中Pi高度亲和，在较大程度上调控低磷条件下植株的磷素吸收能力，进一步对低磷逆境下植株的干物质生产能力产生重要影响。

植株对丰、 缺磷条件下介质中磷素的吸收，是由高、 低磷吸收运载系统分别介导完成的[1,3]。其中，高、 低亲和PT成员分别是上述磷素吸收运载系统的重要组分[1-3]。本研究发现，在丰磷条件下，与中国春(CS)相比，3BS以及其他B染色体组双端体的单株干重、 全磷含量、 单株磷累积量和磷效率没有差异。表明该供磷水平下植株的磷素吸收能力和干物质生产能力与3B染色体长臂的缺失以及TaPht1; 4的存在与否无关。这与TaPht1; 4是高亲和运载系统组分， 该系统主要参与低磷逆境下植株的磷素吸收，而在丰磷条件下植株对介质的磷素吸收由其他低亲和PT成员介导有关。有关参与丰磷条件下小麦磷素吸收的低亲和PT基因及其调控植株吸收和转运磷素的分子机理有待进一步探讨。

小麦不同基因型(品种)在磷素吸收和利用能力上存在明显的遗传学差异[9]。阐明小麦抵御低磷逆境能力的分子标记对于耐低磷小麦遗传学材料鉴定、 磷高效小麦育种后代材料筛选以及小麦品种(品系)的磷效率评价具有重要指导意义[8, 10-11]。本研究对低磷胁迫条件下不同低磷吸收效率的小麦品种中TaPht1; 4表达水平、 干物质生产特征和磷素吸收能力的研究表明，不同磷吸收效率小麦品种低磷逆境下的单株干重和单株磷累积量与TaPht1; 4的表达水平密切相关。因此，TaPht1; 4可作为低磷胁迫下小麦磷素吸收和干物质生成能力的分子评价指标。

综上，本研究表明， 小麦高亲和PT基因TaPht1; 4定位在3B长臂。丰磷条件下，与CS相比，3BS的单株干重、 全磷含量、 磷累积量和磷效率没有改变； 低磷条件下，3BS的单株干重和磷累积量较CS显著降低。丰、 缺磷条件下，不同磷吸收效率小麦品种TaPht1; 4的表达水平与植株干重和单株磷累积量密切相关。TaPht1; 4能显著增强小麦在低磷逆境下的磷素吸收能力，可作为小麦品种耐低磷能力的分子评价参考指标。

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