添加三种外源蛋白研制生物有机肥及其促生效果

张 苗， 施娟娟， 曹亮亮， 李 荣， 张 杨， 梁晓琳， 沈其荣

(农业部长江中下游植物营养与肥料重点实验室， 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，江苏省协同创新中心， 南京农业大学资源与环境科学学院， 江苏南京 210095)

生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料[1]。此类肥料含有大量具特定功能的微生物，其生命活动是生物有机肥优于普通有机肥的关键因素。生物有机肥具有减少或代替部分化肥、农药的使用[2-3]，增强作物抗逆性[4-5]，改善作物品质[6-7]，改良土壤[8-9]等优势，已经越来越多地被人们所认可并在生产上广泛应用。目前，多以秸秆、鸡粪、酒糟、牛粪、猪粪或葛根菌糠等单一的固体废弃物为有机载体来发酵功能微生物研制生物有机肥[10]，也有一些高端生物有机肥会在畜禽粪便等固体废弃物的基础上添加一定的氨基酸材料促进功能微生物发酵、提高肥料品质，常用的氨基酸添加材料为菜粕[11-12]，大量的研究中菜粕的添加量已经达到50%，虽肥料效果很好，但由于菜粕成本较高，导致该类生物有机肥虽具优异的效果，但大面积推广受到限制。因此，考虑开发更多的廉价蛋白源固体废弃物作为生物有机肥生产中的外源添加氨基酸来代替部分菜饼，在确保生物有机肥品质的前提下大幅度降低肥料成本，将为生物有机肥产业快速发展提供保障。

畜禽粪便经过一次高温发酵后形成的腐熟堆肥，加入外源氨基酸接种植物根际促生菌后，经过短期发酵可研制成兼具有机肥和微生物肥效果的高效肥。本研究选择腐熟的牛粪有机肥为基本有机载体，藻泥、菜粕、羽毛粉三种蛋白质资源为外源添加剂，添加固态发酵BacillusamyloliquefaciensSQR9，研制含PGPR的生物有机肥；同时通过盆栽试验研究该生物有机肥对植株苗期的促生效果，以期为资源化利用以上废弃物和新型生物有机肥的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

具拮抗和促生功能的根际功能菌BacillusamyloliquefaciensSQR9(SQR9)由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室筛选保存[16]。功能菌SQR9种子悬液的制备：采用液体LB培养基，在30℃、 170 rpm摇床条件下培养12 h的SQR9种子发酵液，按照5%的量接入到液体LB培养基中，相同条件下摇床培养36 h。

盆栽黄瓜品种为津春四号、茄子品种为江蔬苏琦茄。盆栽土壤基本性状为pH 6.39、有机碳含量为28.69 g/kg、速效氮 79.41 mg/kg、速效磷 25.77 mg/kg、速效钾 59.44 mg/kg。

1.2 菌株SQR9的计数方法

菌株SQR9采用选择性培养基：蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g、琼脂 2.5%、去离子水 1000 mL，1%多粘菌素2 mL/L、1%放线菌酮4 mL/L[17]。功能菌SQR9数量采用梯度稀释平板计数法，将肥料样稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同梯度稀释液。用无菌吸管各取0.1 mL涂布于相应培养基平板中，不同梯度各三个平板，涂布均匀，于30℃培养箱中培养36 h后计数。功能菌数量以每克肥料干重计算，以cfu/g 干重表示。

1.3 条件单因素试验的设计

功能菌SQR9接种量的确定：牛粪有机肥添加量85%，菜粕、羽毛粉和藻泥添加量均为5%，固体发酵含水量40%，接种量设为2.5%、5%、7.5%、10%和15%(V/W，体积质量比)，发酵温度室温(30±2℃)；固态发酵条件同上。

1.4 三因素水平的确定

菜粕参试水平确定：藻泥5%，羽毛粉5%，菜粕含量设为1%、5%、10%、15%、20%和25%六个水平。藻泥参试水平确定：菜粕5%，羽毛粉5%，藻泥含量设为1%、3%、5%、7%、9%和11%六个水平。羽毛粉参试水平确定：菜粕5%，藻泥5%，羽毛粉含量设为1%、5%、10%、15%、20%和25%六个水平。其他发酵条件同上。

1.5 正交试验

对藻泥、菜粕、羽毛粉三因素选取的三水平，采用三因素三水平的固态发酵正交试验选择最佳配方组合，采用L9(34)正交表安排试验。

1.6 游离氨基酸和短肽含量测定

总游离氨基酸和短肽含量测定方法参考Airhart等[18]，方法稍加修改。肥料和0.1 M的HCl以1 ∶10的比例混合，室温150 rpm震荡1 h后，6000 rpm离心10 min取上清，茚三酮测定法测定总游离氨基酸和短肽含量。

1.7 盆栽试验

1.8 数据分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法(Least significant difference, LSD) 检验进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 含水量和接种量对菌株SQR9固态发酵的影响

不同的含水量对菌株的固态发酵效果如图1A所示，40%的含水量最适于菌株SQR9的固态发酵，发酵效果显著高于其他处理；含水量高于45%后，随着含水量的升高菌株SQR9的菌落数显著下降，高于50%后，处理间无显著性差异；含水量为30%和35%时，菌株的发酵效果无显著性差异。因此，后续试验含水量均设为40%。

不同的初始接菌量对菌株的固态发酵效果如图1B所示，随着接菌量的提高，功能菌SQR9的菌落数逐渐提高，但当接菌量大于7.5%时，接菌量对最终肥料中的功能菌活菌数无显著性影响，从生产成本考虑，后续试验的初始接菌量为7.5%。

图1 发酵含水量(A)、接种量(B)对SQR9菌落数的影响Fig.1 The cell density of strain SQR9 under different moisture contents (A) and the initial inoculation (B)

2.2 三因素水平选择

在含5%菜粕和5%羽毛粉的混合堆体中添加不同含量藻泥对功能菌的发酵效果如图2A所示，在添加量低于7%时，随着藻泥加入量的增加，功能菌数量逐渐增多；高于7%时，随着藻泥加入量的增加，功能菌数量逐渐减少；藻泥添加量为7%时，功能菌数量达到1.93×108cfu/g，其与5%添加量的发酵效果无显著差异。从功能菌的固态发酵数量和资源化废弃藻泥的需要两方面考虑，本研究最终选择5%、7%、9%为正交参试水平。

在5%藻泥、5%羽毛粉的基础上加入不同含量菜粕的发酵效果如图2B所示，随着菜粕含量的增加，SQR9的菌数随之增加。当菜粕含量达到10%时，功能菌增加幅度降低，菜粕含量10%条件下发酵菌数达到2.35×108cfu/g， DW，25%条件下发酵菌数达到2.78×108cfu/g， DW，无倍数增加。考虑到菜粕的成本问题，选择正交因素水平为8%、10%、12%。

在5%菜粕、5%藻泥的基础上加入不同含量的羽毛粉，结果如图2C所示，随着羽毛粉含量的增加，菌株SQR9菌落数随之增加，在含量达到15%时菌落数达到最多，之后，随着羽毛粉的增加菌数降低。最终以15%为界点，选择正交因素水平为12%、15%、18%。

图2 不同含量藻泥(A)、菜粕(B)、羽毛粉(C)对SQR9发酵菌落数的影响Fig.2 The cell density of strain SQR9 under different algal sludge(A), rapeseed cake (B) and feather powder(C) amounts

2.3 正交试验结果

为进一步优化发酵配方，对发酵的三种外源添加原料进行三因素三水平正交试验(表1)。结果如表2所示，由表2的直观分析结果显示，A因素的极差最大，B因素、C因素次之，因此，影响菌株SQR9菌落数各因素顺序为A>B>C，藻泥的影响最大，其次为菜粕，而羽毛粉影响最小。试验结果的方差分析结果表明，不同水平的藻泥和菜粕对功能菌发酵菌落数有显著性影响(P<0.05)，而羽毛粉影响则较小，未达到显著性(表3)。统计分析结果可得最优水平组为A1B1C1，即藻泥5%、菜粕8%、羽毛粉12%。

表1 L9(34)正交试验表头设计表

2.4 不同施肥处理对黄瓜、茄子生长的影响

盆栽试验中新型生物有机肥配方(BIO)、普通生物有机肥(BOF)以及有机肥(OF)对黄瓜、茄子株高、茎围、SPAD值的影响如图3、图4所示。图3结果显示，移栽20天时，BIO处理的黄瓜株高和茎粗显著高于OF对照，与BOF相比无显著性差异，BOF处理的植株株高和茎粗均高于OF对照，二者之间无显著性差异，各处理间的SPAD值也无显著性差异；移栽30天时，BIO处理的株高和茎粗均显著高于其他两个处理，BOF处理的株高显著高于OF对照，茎粗高于OF对照但无显著性差异，各处理间的SPAD值同样无显著性差异；移栽40天时，BIO处理的株高与BOF处理和OF对照株高的差距增大且存在显著性差异，其株高分别比BOF、OF高出15.51%、23.57%，BOF处理的植株株高和茎粗均高于OF对照，SPAD值在40天时，BIO处理显著高于BOF处理和OF对照。图4结果显示，茄子移栽20天、30天、40天，BIO处理的株高、茎粗均显著高于BOF和OF对照； 40天时，BIO株高、茎粗相对BOF分别增加35.89%、10.36%，与OF相比，BOF处理的株高和茎粗虽无显著性差异，但均高于OF对照，仍具有一定促生效果，移栽40 d时，BIO处理的SPAD值显著高于BOF处理和OF对照。

表3 菌株SQR9菌落数方差分析

图3 不同施肥处理对黄瓜株高、茎粗、SPAD的影响Fig.3 Effects of different fertilizer treatments on cucumber height, stem diameter and SPAD

图4 不同施肥处理对茄子株高、茎粗、SPAD值的影响Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on eggplant height, stem diameter and SPAD

移栽40 d，不同施肥处理对两种植株生物量的影响如表4所示。BIO处理与BOF处理和OF对照相比，黄瓜和茄子地上部鲜重、干重，地下部鲜重均存在显著性差异。BIO处理的黄瓜地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重比BOF处理分别增加了51.15%、 19.59%、 5.49%和17.75%，比OF处理分别增加了65.56%、 33.49%、 18.90%和37.96%。BIO处理的茄子地上部鲜重、 地下部鲜重、 地上部干重和地下部干重比BOF处理分别增加134.29%、 29.73%、 70.28%和40.34%，比OF处理分别增加154.07%、 38.03%、 76.79%和73.96%。可见新型生物有机肥促生效果显著高于普通的生物有机肥和有机肥。

盆栽试验中BOF、BIO处理肥料基本理化性质如表5。与BOF处理相比，外源氨基酸的添加一方面促进了功能菌的固态发酵，BIO处理中的菌落数为BOF处理中的12.13倍；同时肥料中N和P养分的含量分别增加了1.5个百分点和0.41个百分点，且游离氨基酸和短肽总含量(TAPS)远远高于BOF处理。

表4 不同施肥处理对黄瓜、茄子生物量的影响

表5 生物有机肥基本理化性质

3 讨论与结论

正交试验结果表明，藻泥是影响功能菌发酵的主要因素，菜粕其次，羽毛粉对功能菌的发酵没有显著影响。藻泥成为发酵的主要因素，推测是由于藻泥富含大量易于微生物利用的营养物质，所用藻泥在打捞站已堆放一个多月，部分物质可能已经初步分解，从而有助于功能菌增殖。菜粕同样是影响功能菌增殖的主要因素，菜粕堆肥作为一种优质的外源添加氨基酸，由于其富含氨基酸及活性多肽，具有碳源活性高、氮素有效性高的特性[27]，已经被广泛证明能够推动功能菌的固态发酵[11]。膨化羽毛粉对于功能菌株的发酵影响最小，可能是因为羽毛粉中大量的角蛋白由于二硫键的交联作用成为了复杂的三维网状结构，难以被微生物降解所导致[28]。

盆栽试验结果表明，在氮磷钾养分补齐的前提条件下，与腐熟牛粪有机肥相比，普通生物有机肥在各项促生指标上虽没有达到显著性差异，但促生效果仍然优于普通有机肥，推断是由于生物有机肥中含有更大量的功能菌BacillusamyloliquefaciensSQR9，该菌株首次被鉴定为Bacillussubtilis，目前根据全基因组的分析，已被重新归类为Bacillusamyloliquefaciens，菌株的促进植物生长的效果已经被证明[29]；含外源氨基酸研制的生物有机肥的促生效果显著优于普通生物有机肥和有机肥，这可能是由于该肥料中不仅含有大量的功能微生物，同时外源蛋白的添加增加了肥料中的养分、游离氨基酸和短肽的含量，氨基酸已经被广泛证明能够有效促进植物的生长[30, 31]。

本研究结果表明，根际促生菌SQR发酵基本条件为含水量40%、接菌量7.5%，正交配方组合为藻泥5%、菜粕8%、羽毛粉12%、牛粪75%。本研究初步开发了藻泥和羽毛粉两种废弃蛋白资源和菜粕为固态发酵添加剂，发酵功能菌研制生物有机肥的新配方，此新型的生物有机肥的生产，能够在保证肥料效果的前提下，大幅度降低生物有机肥料的成本，研究结果同时能够为该类废弃资源的循环利用提供理论依据。

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