猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

拜廷阳，赵德明，吴志明，闫若潜，刘淑敏，赵明军,刘梅芬

巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)是一类在自然界普遍存在而又有严格种属特异性的病毒，属β疱疹病毒亚科，致猪发病的为猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus，PCMV)，是一种条件性传染病。该病毒首次从英格兰分离，是继伪狂犬病毒之后发现的第2个猪疱疹病毒[1]。患猪特征性临诊症状为食欲废绝，母猪繁殖障碍，表现为流产、死产、木乃伊胎、产弱仔等；仔猪有明显的眼炎、鼻炎和肺炎症状，生长发育不良，增重差。本病毒分布广泛，大多数常规条件下饲养的猪群均存在PCMV感染，而且抗体阳性率都很高，但一般为亚临床型。自从1955年Done首次报道该病以来，在英国、日本、德国、美国和澳大利亚等地区猪群的血清抗体阳性率大于90%。在感染猪群中，血清抗体阳性率高达98%；近年来，猪群中PCMV感染呈现上升趋势，且多与猪蓝耳病等混合感染，大大加剧患猪的病死率[2]。在日本1972年就有本病病理学方面的报道[3]。随着器管移植技术的发展，PCMV作为猪源病毒，对异种移植构成的潜在威胁也引起了相应重视[4-6]。

建立PCMV的快速诊断对该病的早期诊断、防治及公共卫生等具有重要的意义。传统的病毒分离方法需进行体外细胞培养增殖并观察细胞病变，但由于PCMV在体外增殖较困难，所需时间长，费时费力，难以推广应用。因此建立猪巨细胞病毒快速、敏感、定量、特异的诊断方法非常必要。迄今为至，尚无利用FQ-PCR检测PCMV感染的相关报道。特对建立PCMV TaqMan FQ-PCR检测进行试验，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 KingFisher全自动核酸提取仪为美国Thermo Fisher公司产品；ABI 7000荧光定量PCR 仪为美国应用生物技术公司产品；梯度PCR仪为德国Biometra公司产品；分光光度计(UV-2450)为日本岛冿公司产品；凝胶成像分析系统为美国Alpha Innotech公司产品。DNA回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒等均购自大连(宝)生物工程有限公司；磁珠法核酸全自动提取试剂盒购自Ambion生物科技公司；pGEM-T Easy载体购自Promega公司 。

1.2质粒、菌毒株及检测样品 重组质粒pGEM-T/PCMV由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存。猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV) 、猪伪狂犬病毒(PRV)、高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)、猪链球菌(SS)由河南省动物疫病防控制中心实验室提供。ST 传代细胞源猪瘟(CSFV)活疫苗毒株为产品。检测样品采自河南省部分猪场，诊断为临床疑似PCMV感染后采集的15份病死猪扁桃体样品，样品加入适量PBS液匀浆后离心提取上清液和PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV的培养液态样品，按照文献报道的方法[7]利用Kingfisher全自动核酸提取仪、采用磁珠法进行DNA和RNA的提取。

1.3引物与TaqMan探针的设计与合成 根据GenBank中DNA聚合酶基因保守序列，利用Primer Express 3.0软件设计1对特异引物对P1/P2(P1：5′-TGG CAC TGA TAC TTG ACA AGC -3′/P2(5′-CTC CCG TGA AGC CGT AAA A-3′) 和TaqMan 探针(FAM-5′- CAG CTT GCC CTC AAG GTG ACG TG -3′-TAMRA)。引物和探针由大连(宝)生物工程有限公司合成。

1.4引物和探针浓度的筛选 用矩阵法对FQ-PCR的循环参数、引物和探针浓度以及所选引物与探针的组合等进行筛选优化，以得到最佳的荧光定量PCR反应条件。

1.5敏感性试验及标准曲线的建立 用含pGEM-T/PCMV重组质粒的溶液作标准品，10倍系列稀释成1.0×1010～1.0×100拷贝/μL，共11个稀释度，以不同浓度的重组质粒为模板进行FQ-PCR敏感性试验。以起始模板数的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立PCMV检测的标准曲线。

1.6特异性试验 采用pGEM-T/PCMV重组质粒作模板进行实时荧光定量特异性实验，按照文献报道[8]的方法利用Kinfisher全自动核酸仪、采用磁珠法进行PCV2、PPV 、PRV、PRRSV、SS、CSFV的总DNA和RNA提取，并采用河南省动物疫病预防控制中心已建立成功的RT-PCR方法对RNA病毒进行全长反转录，然后对反转录得到的cDNA和提取的总DNA进行FQ-PCR检测，并设空白对照以检验本方法的特异性。

1.7稳定性和重复性试验 用FQ-PCR法对模板质粒DNA 含量分别为1.0×108，1.0×106和1.0×104拷贝/μL的3个浓度样品分别进行6次重复检测，以检验该检测方法的稳定性和重复性。

1.8与常规PCR检测灵敏度的比较 以pGEM-T/PCMV重组质粒为标准品，10倍系列稀释成1.0×1010～1.0×100拷贝/μL，以其为模板进行FQ-PCR，同时利用河南省动物疫病预防控制中心已建立成功的PCMV常规PCR检测方法进行对照检测，以比较2种方法检测灵敏度。

1.9临床应用性试验 提取临床表现为食欲下降、精神沉郁，皮肤发红、眼睑水肿或严重的结膜炎，喷嚏、咳嗽、流泪、鼻腔分泌物增多，下颌水肿等疑似PCMV感染的病死仔猪的15份扁桃体样品总DNA，以pGEM-T/PCMV为阳性对照、无菌双蒸水为阴性对照进行FQ-PCR扩增；同时进行常规PCR检测，以验证二者的符合率。

1.10病毒在不同内脏器管分布检测 选取6头PCMV FQ-PCR检测结果为阳性的猪，采用建立的FQ-PCR方法对来自同一头猪的血清和扁桃体、肺脏、气管、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、肾脏、肝脏、膀胱、胃、心脏、小肠等内脏器管进行PCMV病毒含量检测，以比较PCMV在猪体不同器官的含量分布。

2 结 果

2.1pGEM-T/PCMV重组质粒DNA浓度的测定 提取的pGEM-T/PCMV重组质粒DNA经分光光度计测定，其100倍稀释的OD260平均值为0.046，OD280平均值为0.024 6，OD260/ OD280平均值为1.870。参照文献的方法[8]，计算所提质粒DNA溶液的浓度为6.18×1010拷贝/μL。由于所克隆基因在PCMV中为单一拷贝，故用此质粒DNA作为标准品制作标准曲线。

2.2FQ-PCR反应条件的确定 采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，结果表明，采用终浓度为5 μmol/L的引物浓度和2.5 μmol/L的探针浓度对质粒标准品进行检测，可获得较小的反应循环数(Ct值)和较大的荧光信号(△Rn)。FQ-PCR循环条件优化结果表明，双温循环及60 ℃的退火温度为最佳的循环条件。确定的FQ-PCR反应总体积为25 μL，其中10×ExTaqBuffer 2.5 μL(Mg2+浓度为2.0 mmol/L)，dNTPs 2 μL，ExTaq酶 0.25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，探针0.25 μL(10 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 18.00 μL，混合均匀，置ABI 7 000荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。反应程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸40 s，共进行40个循环。在每个循环延伸结束时进行荧光信号检测，荧光模式设为FAM/TAMRA双标记模式。

2.3标准曲线及FQ-PCR的灵敏度 以10倍系列稀释的标准pGEM-T/PCMV重组质粒 (1.0×1010～1.0×100拷贝/μL)为模板进行FQ-PCR，当重组质粒浓度稀释为1.0×100拷贝/μL时，荧光曲线的最高△Rn值在2 000左右，Ct值为29.87，表明该方法检测时的灵敏度为1.0×100拷贝/μL(图1)。根据检测结果所计算出的标准曲线见图2，曲线相关系数为0.998，斜率为-2.54，截距为38.39，从而可以得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式为：Ct=-2.54×logX+38.39。将由仪器读取的Ct值代入上述表达式即可算出初始拷贝数。

图110倍梯度稀释的PCMV重组质粒的FQ-PCR检测结果

1～11:对应的重组质粒模板浓度依次分别为1.0×1010，1.0×109，1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102，1.0×101和1.0×100拷贝/μL；N. 阴性对照

Fig.1DetectionresultsoftherecombinantpGEM-T/PCMVwith10foldserialdilutionsbytheFQ-PCRassay

Curves from No.1 to No.11 indicate FQ-PCR results of the recombinant pGEM-T/PCMVplasmid concentrations of 1.0×1010, 1.0×109, 1.0×108, 1.0×107, 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, and 1.0×100copies/μL, respectively. Carve N is the negative control.

2.4FQ-PCR的特异性 特异性实验结果表明，以pGEM-T/PCMV重组质粒为阳性对照有荧光响应，而6个对照病原体、阴性对照无荧光响应(图3)，说明所建立的PCMV FQ-PCR检测方法具有好的特异性。

2.5FQ-PCR的稳定性和重复性 以3个浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒为标准品进行了6次重复测定，其结果如图4所示。通过计算及统计分析得知，起始浓度为1.0×108，1.0×106，1.0×104拷贝/μL的pGEM-T/PCMV重组质粒标准品的最终实际测得值分别为1.001×108，1.002×106，0.999×104拷贝/μL，表明此方法具有良好的稳定性和重复性。

图2 根据图1的结果建立的标准曲线

图3FQ-PCR方法的特异性

1: 阳性对照； 2～6: PCV2、PPV 、PRV、PRRSV、SS、CSFV；N: 阴性对照

Fig.3SpecificitytestresultsoftheFQ-PCRmethod

Curves of No.1 indicate the FQ-PCR results of recombinant pGEM-T/PCMV plasmid with concentrations of 1.0×107copies/μL, respectively.

Curves from No.2 to No.6 indicate the FQ-PCR results of the controls including the PCV2, PPV, PRV, PRRSV, SS, and CSFV, respectively.

Carve N indicates the FQ-PCR results of the negative control.

图4FQ-PCR的稳定性和重复性试验

1～3: 自左向右分别以浓度为1.0×108，

1.0×106，1.0×104拷贝/μL的pGEM-T/PCMV重组质粒为模板FQ-PCR方法重复扩增6次的结果

Fig.4AccuracyandrepetitionassayresultsoftheFQ-PCRmethod

Curve from No.1 to No.4 indicated the repetition 6 times results of the recombinant pGEM-T/PCMV plasmid with the concentrations of 1.0×108, 1.0×106and 1.0×104copies/μL, respectively.

2.6FQ-PCR与常规PCR检测灵敏度的比较 采用常规PCR方法检测时，检测的极限灵敏度为1.0×102个拷贝/μL；FQ-PCR的检测灵敏度为1个拷贝/μL(图1)；表明 FQ-PCR方法的检测灵敏度是常规PCR检测方法的100倍。

2.7FQ-PCR与常规PCR对临床样品检测结果的比较 将疑似PCMV感染扁桃体组织样品和pGEM-T/PCMV阳性重组质粒，分别采用所建立的FQ-PCR和常规PCR进行检测。结果二种检测方法均检出9份阳性样品，对pGEM-T/PCMV阳性重组质粒的检测结果为阳性，二种方法检测结果完全相符(图5，图6)。

图5疑似PCMV感染扁桃体组织样品常规PCR检测结果电泳图

M:100 bp DNA标准分子量对照；P: 阳性对照(pGEM-T/PCMV)；N:阴性对照；1～15:临床疑似PCMV感染猪扁桃体病料

Fig.5RoutinePCRamplificationofthe15clinicsuspiciousPCMVinfectedtonsiltissues

M: 100 bp DNA marker;P and N: PCR results of the positive and negative control, respectively;

Lane 1-15: 15 clinic suspicious PCMV infected tonsil tissue samples, respectively.

图6FQ-PCR检测临床疑似样品部分应用试验

1：pGEM-T/PCMV；2～10：PCMV阳性样品的FQ-PCR扩增曲线；11～16：PCMV阴性样品的FQ-PCR扩增曲线；N：空白对照样品

Fig.6ApplicationofFQ-PCRassaybydetectionoftheclinicsuspiciousPCMVinfectedtonsiltissue

1: Curves of the recombinant pGEM-T/PCMV plasmid;

2-10: Curves of the 9 positive samples of the 15 clinic suspicious PCMV infected samples;

11-16: Curves of the 6 negative samples of the 15 clinic suspicious PCMV infected samples;

N: Blank negative sample control

2.8病毒在不同内脏器管分布 对6头PCMV检测结果为阳性猪的血清和不同内脏器官中PCMV病毒含量的定量检测排序结果完全一致，其中PCMV含量最高的器官为猪扁桃体，最低的为小肠；按照病毒含量从高到低的顺序依次为：扁桃体、肺脏、肾脏、胃、心脏、腹股沟淋巴结、肝脏、膀胱、肠系膜淋巴结、气管、血清、脾脏、小肠。

3 讨 论

目前，国内外有关PCMV感染状况的研究较少，开展PCMV病原学快速诊断方法研究，可掌握PCMV在我国猪群中的感染状况，了解PCMV近年来对猪群健康的危害，从而及早采取有效防控措施防控该病的流行和发生。另外，在异种器官移植方面，猪是异种移植器官供体的最佳候选者[9]，近年来, 国外关于PCMV的报道主要集中在其对异种移植的影响方面, 研究发现β疱疹病毒包括人疱疹病毒6型、7型(HHV-6、HHV-7)及CMV能够在器官移植后引起器官移植受者产生机会感染, 由此产生一系列症状和疾病, 统称为人巨细胞病毒疾病。目前虽然没有PCMV在体内传染给人类的直接证明, 但已有研究表明PCMV在体外能在人成纤维细胞中增殖[10]，因此PCMV可能由带毒猪器官随器官移植传染给人，成为人体器官移植的重要传染病[11-13]。本研究进一步证明同为疱疹病毒科的PCMV可能是异种移植中潜在的动物传染源。鉴于PCMV在猪体内的高阳性率, 对于人类, PCMV也可能成为一种潜在的风险源。

PCMV的详细基因组结构尚不清楚，仅见有DNA聚合酶(DPOL)、gB、MCP等几个基因的研究。DPOL是PCMV能正确和高效复制所需的基本因子之一，是PCMV血清型特异性的单拷贝基因，选取DPOL基因为靶基因设计PCR引物，可确保PCMV PCR检测的特异性。本研究所建立的FQ-PCR方法以PCMV的DPOL基因为模板设计探针和引物，在特异性方面具有双重保证，因此具有较常规PCR更高的特异性。特异性试验和敏感性试验表明，FQ-PCR对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒呈现阳性反应，可检测到1拷贝/μL的病毒，而对6个对照病原菌均呈现阴性反应，说明本研究所建立的FQ-PCR方法具有很高的特异性和灵敏度。另外，对同一样品重复多次检测均可得到一致的Ct值和荧光强度，表明所建立的FQ-PCR方法具有很高的稳定性和重复性。利用FQ-PCR方法进一步对15份临床疑似PCMV感染病死仔猪扁桃体组织样品进行了检测，其检测结果与常规PCR方法的检测结果完全一致，说明该方法可成功用于PCMV快速诊断和临床应用检测。

迄今为止，国内外已有多名学者报道建立了针对PCMV的常规PCR检测方法[14-17]，但尚未有PCMV荧光定量PCR检测方法的报道。本研究首次建立了PCMV荧光定量PCR诊断方法，与常规PCR方法相比，该方法诊断更加迅速，整个反应可在1～2 h内完成，而且不需要电泳，从而大大降低了对环境的污染，且其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍，并能实现对样品的实时定量检测。因此， FQ-PCR方法对于PCMV的早期快速检测诊断、防控、净化及研究PCMV与其它病原体的混合感染及相互作用等方面具有意义。

本研究对来自6头PCMV检测结果为阳性猪的血清和不同内脏器官中的PCMV含量进行了定量研究，尽管6头猪的同一器官中PCMV病毒含量不尽相同，但不同内脏器官中PCMV病毒含量排序结果完全一致，即扁桃体、肺脏、肾脏较高，肠系膜淋巴结、气管、血清、脾脏、小肠较低。这为PCMV的检测、诊断、分离等研究提供了依据。

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