浅谈蛋白质含量的定量检测方法

2014-04-07周跃男王湛赵小川张西明高悝程立娜刘利萍

食品研究与开发 2014年7期

周跃男，王湛，赵小川，张西明，高悝，程立娜，刘利萍

（1.北京工业大学环境与能源工程学院，北京100124；2.天津市武清区新闻中心，天津301700）

蛋白质是构成细胞不可缺少的成分，它是生命的物质基础，与细胞结构、营养代谢、酶等密切相关，它的定量测定是食品和质量检验、医药分离提纯中最重要的工作之一[1]。蛋白质的测定方法也在不断的发展中，有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲比色法、Folin-酚法、考马斯亮蓝法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、滴定法及电泳法等方法，本文就常见的这几种方法进行讨论。

1 凯氏定氮法

1.1 原理[2-3]

凯氏定氮法测定蛋白质含量的过程主要分为以下四步：

1）消化。在催化剂和浓H2SO4的作用下，蛋白质加热消化分解为氨态氮，氨态氮再与浓H2SO4结合生成（NH4）2SO4。

2）蒸馏。消化完全后，加入强碱进行蒸馏，使铵离子转化为NH3释放出来。

3）吸收。用标准的H2BO3溶液吸收NH3。

4）滴定。用标准的盐酸滴定，并用甲基红为指示剂。测出铵离子的量，最后换算出粗蛋白质的含量。

1.2 特点

凯氏定氮法是目前世界上测定蛋白质样品中总有机氮的最准确和最简单的方法之一，广泛应用于各类蛋白质的测定，可分为常量和微量凯氏定氮法两种。但存在灵敏度低、操作复杂、耗时过长、试剂消耗量过大等缺点[4]。

1.3 案例

以下两种方法主要是在消化方式和仪器上进行改进，效果较为满意。

刘玉兰等[5]对凯氏定氮法的消化方式进行了改进，用H2O2和浓H2SO4的混合液对蛋白质样品进行消化，消化完全后再以甲醛法来测定粗蛋白质的含量。该方法的改进效果是：消化时间较经典凯氏定氮法缩短了11/12，同时测定结果与经典凯氏定氮法的测定结果基本一致。说明该方法极大的改善了经典凯氏定氮法的缺点，可用于食品中蛋白质的大批量的测定。

蒋江虹等[6]用2300型全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质，测定原理与经典凯氏定氮法相同。该方法的改进效果是：该方法因采用机电一体化控制而减少了经典凯氏定氮法过程中人为操作的误差，具有操作简便、快速、准确度高等优点。

2 分光光度法

分光光度法分为紫外吸收法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）、考马斯亮蓝法、BCA法（二喹啉甲酸法）等。

2.1 紫外吸收法

2.1.1 原理

因蛋白质分子中芳香族氨基酸等残基中含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的特性，最大吸收峰在280 nm处。因蛋白质在最大吸收峰处的吸光度与其浓度成正比，可根据蛋白质溶液的吸光度，定量测定测得样品中蛋白质的含量。

2.1.2 特点

紫外吸收法简便、快速、灵敏度高，且测定结果不受低浓度的盐类的干扰[7]。但缺点是：实际应用中的蛋白质，其酪氨酸和色氨酸的含量会和标准蛋白质中的差异较大，导致测定结果存在一定的误差。因而，适应范围存在局限，仅适用于与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量差异较小的蛋白质的测定。

2.2 双缩脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）

2.2.1 原理

因蛋白质含有两个或者两个以上肽键，它会在碱性条件下与CuSO4溶液发生双缩脲反应，反应过程中肽键中的氮原子和Cu2+结合形成紫红色的络合产物[8]。在一定范围内，络合产物颜色的深浅与蛋白质的含量符合朗伯—比尔定律。

2.2.2 特点

双缩脲比色法是2008年公布的中华人民共和国农业行业标准中测定乳与乳制品中蛋白质的方法[9]。作为传统的分光光度法测定蛋白质的方法之一，双缩脲法操作简便、迅速，但缺点是准确度和灵敏度较低，测定范围也为仅为1 mg～20 mg蛋白质[7]。同时，该测定方法受C4H11NO3、EDTA和一些氨基酸等干扰[10]。

2.3 Folin-酚法（Lowry法）

2.3.1 原理

Folin-酚法与双缩脲比色法的原理很类似。蛋白质中的肽键和Cu2+发生双缩脲反应，生成蛋白质—铜络合物。同时，酚试剂被蛋白质-铜络合物上的芳香族氨基酸残基还原，生成深蓝色的化合物。在一定的条件下，化合物颜色的深浅取决于蛋白质的浓度。因而，可根据蛋白质溶液的吸光度，定量测定测得样品中蛋白质的含量。

2.3.2 特点

Folin-酚法广泛应用于测定水溶性蛋白质的含量，较双缩脲法更灵敏。适用于20 μg～250 μg微量蛋白质的测定，最低可达5 μg[7]。但缺点是：Folin-酚试剂配制繁琐耗，且会受到柠檬酸、甘氨酸、Tris缓冲液、甘油[7]、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）[11]、EDTA 和脲素[12]物质的干扰。

2.4 考马斯亮蓝法（Bradford法）

2.4.1 原理

考马斯亮蓝法是Bradford于1976年提出的快速、灵敏的定量测定微量蛋白质的方法。

考马斯亮蓝G-250染料是一种有机染料，它在游离状态下为红色，最大吸收峰在465 nm处。但当它与稀酸中的蛋白质的芳香族氨基酸和碱性氨基酸残基通过范德华力结合后，会由红色变成蓝色，最大吸收峰变为595 nm。在一定条件下，蛋白质-G-250络合物在595 nm处的吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系，故可用于测定蛋白质的含量。

2.4.2 特点

考马斯亮蓝法测定快速、简便、稳定性好、灵敏度高、重现性好、干扰物质较少。但缺点是：该方法的线性关系会随着在蛋白质含量的增加而越来越偏差，同时，当蛋白质的芳香族氨基酸和碱性氨基酸残基含量不同时，它与考马斯亮蓝G-250的结合状况也会不同，因而在不同蛋白质含量的测定中有偏差。同时，此外，该反应会受强碱性缓冲液、十二烷基硫酸钠（SDS）、去污剂、TritonX-100 等物质的干扰[7]。

2.4.3 案例

以下方法主要是在标准曲线和显色液组分方面进行改进，效果较为满意。

郭敏亮[13]等通过研究发现，显色液组分中的H+是影响线性关系的最主要的因素，摒弃传统的H3PO4缓冲溶液，用一个全新的显色液配方来改善了考马斯亮蓝法测定蛋白质的线性关系。

余冰宾[7]在基础生物化学实验指导一书中，提到采用γ-球蛋白作为标准物质，可减少因蛋白质来源的差异造成的测定偏差。

2.5 BCA法（二喹啉甲酸法）

2.5.1 原理

BCA法测定蛋白质含量的过程主要分为以下两步[14]：

1）还原。在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原成Cu+。

2）络合。Cu+与BAC试剂发生反应，在最大吸收峰（562 nm）下处形成紫红色的络合物。一定条件下，络合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因而可用于蛋白质含量的测定。

2.5.2 特点

相比Lowry法，BCA法更优越。它是已知的最灵敏的总蛋白质含量的检测方法之一，检测下限到0.5μg[15]。具有快速、稳定、灵敏等优点。

2.6 磺基水杨酸沉淀法[16]

2.6.1 原理

以磺基水杨酸和无水硫酸钠为试剂，采用磺基水杨酸沉淀法来测定生物制品中的蛋白质的含量。

2.6.2 特点

磺基水杨酸沉淀法测定快速、简便、操作误差小，虽然与凯氏定氮法与Folin-酚法相比准确性偏低，但磺基水杨酸沉淀法有如下优点：（1）克服了凯氏定氮法对蛋白质的浓度过低而致使测定误差大的缺点；（2）弥补了Folin-酚法中由于蛋白质样品中硫柳汞等存在而干扰检测结果的劣势。因而，磺基水杨酸沉淀法不失为一种微量蛋白质的行之有效的方法。

3 滴定法

3.1 原理

滴定法测定蛋白质含量的过程主要分为以下两步：1）消化。该步与凯氏定氮法一致。

2）滴定。用甲醛滴定法或pH滴定法进行滴定。

由于凯氏定氮法存在操作复杂、耗时过长、试剂消耗量过大等缺点，一些研究人员在样品消化后，省去传统凯氏定氮法中蒸馏和吸收两步，直接采用滴定法测定蛋白质含量。

3.2 特点

该法省去凯氏定氮法中蒸馏和吸收两步，克服了凯氏定氮法中的一些缺点，操作简便、快速，不失为一种行之有效的方法。

3.3 案例

冯正滔[17]改善了传统凯氏定氮法，用甲醛法代替蒸馏、吸收、滴定三步。改进后的方法平均回收率和精密度都有了明显提高，同时也克服了传统凯氏定氮法的缺点，为一种可行的测定蛋白质含量的方法。

张大伦等[18]以滴定极弱酸的原理为根据，同样改善了传统凯氏定氮法，用pH滴定法代替蒸馏、吸收、滴定三步，分别测定了大豆及花生蛋白质的含量。结果表明，pH滴定法的测定不仅与传统凯氏定氮法测定结果基本一致，而且经济效益明显，应用前景广泛。

4 电泳法

4.1 原理

在电场作用下，惰性支持介质中带电荷的样品（如蛋白质）向着与其电荷相反的电极方向移动，由于各组分移动速度的差异，使其在电泳区带图谱上形成狭窄的区带，根据谱图可计算样品中蛋白质的百分含量。

4.2 特点

电泳法具有操作简便、快速、自动化程度高等优点。但缺点是：在检测过程中会受脂类、核酸、多糖等的干扰分子。目前，测定蛋白质含量的电泳法可分为毛细管电泳法、双向凝胶电泳法、火箭免疫电泳法等。

4.3 案例

唐萍等[19]通过毛细管电泳法测定雀巢、美赞臣、雅培等知名品牌婴幼儿奶粉中多种蛋白质的含量。研究表明，该法准测定快、精密度和准确度高、绿色无污染，同时它对改善幼儿奶粉配方和监控牛奶的质量提供了一个较好的检测方法。

5 结论

定量检测蛋白质含量的方法有很多，包括：凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲比色法、Folin-酚法、考马斯亮蓝法、BCA法、磺基水杨酸沉淀法、滴定法及电泳法等。每种检测方法各有优缺点，我们应充分了解这些测定方法的原理和特点，并在科研检测工作中根据具体的情况选用适宜的、常用的分析方法，这样才能获得更好的检测结果。

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[6] 蒋江虹,革丽亚,麦琦.全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质[J].光谱仪器与分析,2006(1/3):258-260

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[12]张世军,孙淑斌,李思健.几种蛋白质微量测定方法的比较[J].曲阜师范大学学报,1995,21(32):87-90