慢性过敏性哮喘大鼠模型的建立与评价

乔 明, 刘兰英, 王和生

(1. 南京中医药大学, 南京 210000; 2. 江苏省中医院, 南京 210000)

·综 述·

慢性过敏性哮喘大鼠模型的建立与评价

乔 明1, 刘兰英2, 王和生2

(1. 南京中医药大学, 南京 210000; 2. 江苏省中医院, 南京 210000)

为制备出接近人类慢性过敏性哮喘特征的大鼠模型提供研究基础。本文总结国内外近年来慢性过敏性哮喘大鼠模型的建立方法，从模型大鼠品系的选择、造模方法、模型评价等几个方面来综述。

慢性过敏性哮喘 大鼠模型 综述

哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞、结构细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。全世界大约有3亿人患哮喘，而且哮喘发病人数呈上升趋势[2]。目前, 人类对哮喘发病的生理学、免疫学机制尚未明确。由于人体研究存在局限性及伦理学上的限制，对哮喘的研究往往需要通过动物模型来进行。但是，目前大鼠哮喘模型大多是经短时间致敏、激发而建立的急性模型[3]，往往形成急性气道炎症，缺少慢性气道炎症及气道增厚重塑为特征的慢性过敏性哮喘模型, 不能模拟哮喘病人反复接触过敏原使病情逐渐恶化的过程。近年来, 关于慢性过敏性哮喘大鼠模型的研究越来越多。本文对慢性过敏性哮喘大鼠模型的研究进行综述, 为制备出接近人类慢性哮喘特征的大鼠模型提供研究基础。

1 常用大鼠品系

大鼠容易被致敏,易于制作哮喘模型，且大鼠过敏反应与人类哮喘反应特点相似。大鼠过敏反应主要由IgE介导, 激发后易发生速发性与迟发性双相反应，迟发反应出现时间与哮喘患者出现迟发相反应时间接近, 肺部炎细胞浸润、Th2增多、INF-γ分泌的减少及产生的气道高敏持续时间长[4]。在大鼠哮喘模型中更易获得分子生物学研究中所需的材料。大鼠被广泛应用于过敏性哮喘的研究中，但是不同品系之间的大鼠仍存在差异。

1.3.1 BN(Brown-Norway)大鼠 国外关于哮喘研究中多采用BN大鼠，常用于研究药物对气道嗜酸粒细胞增多的影响[5]。该品系模型在特异性抗体的产生及诱发哮喘症状上优势明显，尤其容易引起IgE介导早期过敏反应以及Th2的优势免疫应答[6]。Hylkema等[7]报道，用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)分别致敏BN大鼠和SD大鼠，结果发现BN大鼠中Th2细胞对OVA反应较SD大鼠显著。但BN大鼠价格较昂贵且获取较困难，在国内研究中应用较少。

1.3.2 SD大鼠和W istar大鼠 目前国内常用SD大鼠和W istar大鼠来制备哮喘模型，这两种品系的雌雄大鼠在急、慢性哮喘模型中均有应用。SD与W istar大鼠均为封闭群，遗传背景均相似, 国内有许多文献报道采用SD与W istar大鼠均可以成功复制出哮喘模型[8]。SD大鼠对疾病的抵抗力较W istar大鼠为强, 尤其对呼吸道疾病的抵抗力很强[9]。但在相同条件下W istar大鼠比SD大鼠更容易成功复制出哮喘模型[10]。窦迎婷等[11]在制备哮喘动物模型实践中观察到，在同样致敏和激发条件下，SD与W istar大鼠在哮喘症状表现上、外周血和肺泡灌洗液(BALF) 中嗜酸细胞(EOS) 的数量及肺部嗜酸细胞浸润的病理表现上与对照组相比未见明显差异。

2 模型建立方法

OVA是目前支气管哮喘动物模型中使用最广泛的致敏原[12]。OVA致敏和激发是制作哮喘模型的两个主要步骤，基本方法是腹腔或皮下注射OVA (含或不含佐剂)致敏，OVA生理盐水溶液雾化激发。慢性哮喘模型的建立方法与急性哮喘模型比较, 主要区别在于采用较低浓度长时间的反复激发。

2.1 造模周期

造模周期由过敏反应的两个阶段决定，即致敏阶段和激发阶段。致敏阶段即初次接触抗原，一般需潜伏1～2周才能产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，从而具备发生变态反应的能力。激发阶段即当相同抗原再次刺激机体时，抗原与抗体反应引起机体损伤。

2.1.1 致敏阶段 慢性哮喘大鼠模型致敏周期一般为2周, 在第1、8日分别进行2次。Palmans等[13]用BN大鼠于实验第1、8日每只腹腔内注射0.5 m l生理盐水混合液[含OVA 1 mg+Al(OH)3200 μg]致敏,共2周。魏兵等[14]在研究建立慢性过敏性哮喘的动物模型实验中以OVA悬液1 m l[含OVA 100 mg + Al (OH)3100 mg]在第1、8日致敏SD大鼠，2周后激发。罗俊明等[15]于第1、8日在SD大鼠双上肢内侧、双下肢大腿外侧及腹腔注射1 m l 混悬液[含OVA 1 mg+ Al(OH)3100 mg ], 其中皮下共注射0.4 m l、腹腔注射0.6m l，2周后激发。

2.1.2 激发阶段 在末次致敏后一周进行激发，激发的时间长短差异较大，慢性哮喘模型激发所需的时间一般都在4周以上。李惠民等[16]在研究慢性哮喘的动态模型过程中从第1 5日起雾化吸入1%OVA，3次/周，每次20 m in，分别建立24 h模型、1周模型、2周模以及4周模型。研究发现,随过敏原激发次数的增多, 支气管上皮的损伤和破坏逐渐加重, 同时反映了哮喘时支气管上皮损伤、脱落和异常修复的过程。Yang等[17]在第15日，向置于密闭有机玻璃容器内的大鼠喷雾1% OVA，隔日一次，每次30 min, 持续8周。Palmans等[13]以1%OVA每次雾化30 min，3次/周激发BN大鼠制作2周、4周、12周的模型，发现4周的模型大鼠肺组织嗜酸粒细胞浸润及血清IgE达到峰值。而气道高反应性则会在激发至少6周后出现[18]。

2.2 过敏原的用量

OVA作为目前使用最广泛的致敏原，由于其OVA纯度以及大鼠品种的不同，造成实验中用量有很大差异。文献报道，大约39.8%的文章使用1 mg OVA、21.1%使用10 mg OVA、31.9%使用100 mg OVA致敏[19]。Palmans等[13]以含1 mg OVA和200 μg A l(OH)3混合液0.5 m l腹腔内注射致敏，1%OVA雾化30 min建立慢性哮喘模型。XIE[20]等用含10 mg OVA和200 mg Al(OH)3的生理盐水1 m l,同时腹腔注射百日咳杆菌疫苗6×109个菌株致敏，2% OVA的生理盐水激发。Jin等[21]腹腔内注射1 m l生理盐水配置的含100 mg OVA和100 mg AL(OH)3混合液，第15日起每日用1%OVA激发建立慢性哮喘模型。孟鹏飞等[8]认为实验中采用较高纯度的OVA(Grade V)致敏, 而用低纯度的OVA(Grade Ⅱ)激发较为合适。

3 慢性哮喘模型的评价

全面成功地评价一个与临床发病机制相似的稳定可靠的慢性哮喘模型非常重要, 目前对慢性哮喘大鼠模型是否成功缺乏规范化的统一标准要求。一般认为动物模型是否成功可以通过以下方面说明问题。

3.1 大鼠行为学

慢性哮喘模型大鼠较正常鼠体质量增长缓慢，并表现为竖毛、毛发暗淡，倦怠[22]。雾化激发时大鼠出现典型哮喘样发作，表现为呼吸急促，张口喘息，喷嚏，口唇发绀，前肢缩抬，点头呼吸，腹部翕动及行动迟缓等，并随着激发次数增加症状逐步加重[23～24]。罗俊明等[15]在制备激发12周的慢性哮喘模型时，以大鼠出现烦躁、搔鼻、呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及四肢瘫软等表现视为模型制备成功。

3.2 肺组织病理

组织形态学指标也是评判哮喘模型是否成功的重要指标。哮喘由于急性炎症反复发作而转变为慢性炎症，气道反复损伤与修复, 大量炎性细胞、炎症介质浸润并继发气道重塑[16]。因此, 大鼠肺组织病理切片出现炎性细胞浸润伴有支气管肺泡腔内渗出增多及支气管粘膜水肿等气道重塑改变可表明慢性哮喘大鼠模型已具有哮喘发作的病理学基础[25]。

3.2.1 气道炎症改变 模型大鼠肺组织HE染色: 肺内支气管及血管周围大量炎性细胞浸润, 管腔狭窄，内可见炎性细胞和渗出物增多, 黏液栓形成[26]。模型大鼠肺组织电镜下可见纤毛上皮细胞脱落、嗜酸性粒细胞浸润、胞浆空泡增多、核轻度固缩以及杯状细胞黏液分泌颗粒增多[16]。这些结果和哮喘病人支气管黏膜活检标本支气管上皮的病理学改变相似。高伟良等[27]发现模型大鼠激发4周哮喘组支气管痉挛、上皮细胞脱落、肺泡隔增厚、支气管管壁和伴行动脉周围炎症细胞浸等病理改变较2周哮喘组更重。

3.2.2 气道重塑改变 模型大鼠肺组织HE染色: 气道上皮可见杯状细胞增生肥厚，支气管壁明显增厚，支气管平滑肌增厚，黏膜下水肿，黏膜皱折增多，可见肺大泡等表现[16～17]。哮喘大鼠扫描电镜下可见上皮细胞纤毛脱落、排列紊乱、纤毛黏液毯形成、肺泡隔增宽以及纤毛再生现象[28]。王丽新等[23]研究慢性哮喘大鼠模型气道的重塑的形态学变化时发现，激发2周时杯状细胞增生明显, 上皮下可见嗜酸性粒细胞浸润; 4周时胶原沉积明显;到6～8周时，气道壁厚度增厚最明显。刘中成等[24]观察到OVA激发12周的慢性哮喘大鼠模型较1周急性哮喘模型肺泡间隔炎性细胞减少，气道杯状细胞增生，平滑肌增厚，纤维化细胞增多等气道重塑特征明显加重。

4 结语

慢性哮喘大鼠模型的制作目前没有统一标准。作者认为制备慢性哮喘大鼠模型时，致敏周期为两周2次致敏，根据实验需要可加用免疫佐剂；激发的时间应在4周以上方可诱导出典型的慢性哮喘病理改变。评价模型的指标主要为大鼠的典型哮喘样发作和肺组织炎性细胞浸润伴气道重塑改变等特征性病理学改变。慢性哮喘大鼠模型是进行相关研究的重要基础，其复制方法仍需在以后的研究中进一步规范，以期建立哮喘慢性气道炎症大鼠模型复制与评价的统一标准。

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Establishment and Evaluation of Chronic Allergic Asthma Models in Rat

QIAO ming1, LIU Lan-ying2, WANG He-sheng2
(1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. Jiangsu Province of TCM, Nanjing 210000, China)

To establishment the chronic allergic asthma model, which was similar to chronic human asthma, this paper summarized the rat models of chronic allergic asthma established in recent years, from several aspects such as rat strains, methods, and evaluation of model.

Chronic Allergic Asthma; Rat Models; Review

R-33,Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0079-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.019

2013-10-10

国家自然科学基金(81102632)

乔 明(1991-), 男, 硕士研究生, 研究方向: 针灸, E-mail: 470522236@qq.com

王和生(1965-), 男, 博士, 主任医师, 硕士研究生导师, 研究方向: 针灸。E-mail: wanghesheng2007@126.com