免疫活性肽的酶法制备及其活性机制研究进展

卜汉萍 王 璐 许 宙 程云辉

BU Han－ping WANG Lu XU ZhouCHENG Yun－hui

（长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114）

（College of Chemistry and Biology Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha，Hunan 410114，China）

近年来，随着人们生活方式的转变，人体免疫能力受到诸多因素的影响与挑战，老龄化、肥胖症、饮食不当、生活压力与不良生活习惯皆可导致机体免疫力下降而引发各种疾病，寻求适宜的免疫调节剂来提高人体免疫能力，成为了人类社会的迫切需要。

传统的药物免疫调节剂对机体有一定的毒副作用，而免疫活性肽作为安全无副作用的免疫调节剂在食品、药品与饲料等领域已显出其独特优势，免疫活性肽可通过促进免疫细胞增殖、提高巨噬细胞活性、增强自噬细胞（NK）机能、促进细胞因子生成［1，2］等来提高机体免疫力。

目前，国外学者［3－5］虽然已从多种动植物蛋白中获得了氨基酸序列和结构明确的肽段，并对其活性机理做了系统研究，但工业化制备的免疫活性肽并不多见；国内学者［6－8］对免疫活性肽的研究主要集中在制备方法与分离纯化工艺研究方面，具有明确氨基酸序列和结构的免疫活性肽的报道较少。要对免疫活性肽进行生理活性、结构及其构效关系的研究，首先必须富集得到较高纯度的活性肽，然后再深入研究其免疫活性机制。因此，研究高纯度免疫活性肽的高效制备方法与免疫活性机制皆具重要意义。文章对免疫活性肽的酶法制备、分离纯化和活性机制进行了综述，可为肽类免疫调节剂的开发提供理论参考。

1 免疫活性肽的酶法制备

目前主流的制备免疫活性肽的方法主要有酶解法、微生物发酵法、化学合成法等，因生产条件温和、安全性较高、价格低廉且可得到特定功能的活性肽等优点，酶解法已成为从蛋白质中释放生物活性肽的最常用方法。

虽然食源性蛋白在生物体内的消化过程中也可酶解成氨基酸与多肽类物质，但体内酶解具有不完全性和不确定性，不能有目的地释放出具有特定生物活性的肽段。近年来研究［9］发现蕴藏于蛋白质多肽链中的肽类物质的生理活性往往还强于其母体蛋白，若选择适当的蛋白酶体外水解蛋白，就有可能释放出母体蛋白质中有生理活性的肽段，按工业化规模制备出具特定生理功能的活性肽。

1.1 酶法制备免疫活性肽的底物蛋白

研究表明体外酶解有可能释放出母体蛋白质中有活性的肽段［6］，母体蛋白的氨基酸组成［10］、亚基序列［11，12］与空间结构［13］皆影响着肽的免疫活性。从大量免疫活性肽的研究［14，15］中发现，免疫活性肽通常具有疏水性氨基酸，如Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Pro、Trp等。因此，对制备免疫活性肽的蛋白，有必要对其氨基酸组成与结构进行分析。

目前，制备免疫活性肽的蛋白主要来源于动物与植物蛋白。以动物蛋白作为酶法制备免疫活性肽底物蛋白的研究报道较多，Jolles等［16］采用胰蛋白酶酶解乳蛋白，分离纯化后获得一个具有免疫活性的肽段，研究表明从α－乳白蛋白中获得的免疫活性肽Tyr－Gly与Tyr－Gly－Gly能在体外有效促进人外周血细胞的增殖，增殖率分别为90%和35%，促进细胞代谢过程中蛋白合成（25%）［17］。Jairo Duarte等［18］采用太平洋无须鳕鱼蛋白为原料，利用酵母代谢酶发酵鳕鱼蛋白，探讨发酵物的免疫活性，研究结果表明0.3 mg／m L发酵物连续灌喂小鼠7 d后能有效促进腹腔巨噬细胞的吞噬能力，Ig A＋细胞数量在小肠固有层增加，IL－4、IL－6和IL－10细胞数量在相同位置有显著性增加，此外，IFNγ和TNFaα促炎因子含量也得到增加，因此发酵物能增强小鼠机体的非特异性免疫能力。丁进峰等［19］采用响应面优化的木瓜蛋白酶酶解海蜇胶原蛋白工艺制备免疫活性肽，研究发现在1%加酶量、55℃，p H 6.5，酶解时间180 min的条件下，海蜇胶原蛋白肽能显著促进小鼠免疫器官脾脏指数（4.857 mg／g）和胸腺指数（2.083 mg／g），并且能提高小鼠巨噬细胞的各项吞噬指标，如碳廓清指数0.033、吞噬指数6.645、伴刀球蛋白指数0.220。

以植物蛋白作为酶法制备免疫活性肽底物蛋白的研究报道涉及大米蛋白、大豆蛋白和小麦蛋白。Takahashi M等［20］采用胰蛋白酶水解可溶性大米蛋白，其水解物分离纯化后获得具有免疫调节功能的肽段为 Gly－Tyr－Pro－Met－Tyr－Pro－Leu－Pro－Arg，此九肽能引起豚鼠回肠收缩，具有提高白细胞吞噬功能，吞噬指数为1.5。陈季旺等［21］采用胰蛋白酶酶解米糠，凝胶过滤和RP—HPLC对酶解物进行分离纯化，获得 一 个 氨 基 酸 序 列 为 Asp－Gly－Ser－Val－Arg 的 阿 片 活性肽。

1.2 酶法制备免疫活性肽的酶种

蛋白酶的种类决定了酶解的作用位点和酶解程度，从而可获得具有不同氨基酸组成和分子量的肽段。

胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶与复合蛋白酶常用于制备免疫活性肽。房新平［22］、Hu Hou等［23］以淋巴细胞增殖活性为考察指标，采用胰蛋白酶分别对牛胎盘蛋白、阿拉斯加鳕鱼进行酶解，皆获得具有免疫活性功能的肽段。JingJiao Ma等［24］用碱性蛋白酶酶解乳清蛋白，以淋巴细胞增殖活性作为检测指标，研究发现酶解物较母体蛋白能更显著地促进细胞增殖，脾淋巴细胞增殖指数为1.71。马俪珍等［25］以脾淋巴细胞增殖指数为指标，采用正交试验考察了酶（木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶与碱性蛋白酶）、底物浓度、酶解时间和加酶量等因素的影响，研究发现采用木瓜蛋白酶在加酶量1 600 U／g，4 h，底物浓度1∶4.5（m∶m）条件下，能够获得较高免疫活性的多肽。

1.3 水解度对酶法制备免疫活性肽的影响

水解度（DH）可以反映蛋白质被水解的程度，在相同条件下它与酶的种类及活力、底物种类有关。DH越高，蛋白质水解得越彻底，获得的分子量较小的肽段就越多，免疫活性肽的分子量大多小于2 k Da，但过高DH将产生较多的游离氨基酸。可以通过水解度来控制酶解反应的进程，但仅用DH作为考察指标是不完善的，通常应结合生理活性指标来考察制备免疫活性肽的工艺条件。

曾珍等［26］选用不同蛋白酶酶解兔骨粉，以DH和小鼠淋巴细胞增殖指数（SI）作为指标，筛选较适宜的蛋白酶，并优化酶解工艺，研究结果表明，采用胰蛋白酶酶解兔骨粉，DH对SI有显著影响，随着DH不断提高，SI值的变化趋势是先增大后减小，可能是因为随着DH提高，具有免疫活性的肽段被进一步降解了。Xiang Zhen Kong等［27］比较了 DH对3种大豆蛋白（InSP、SPI与SSP）水解物分子量的影响，相同条件下，InSP的DH较其它两种蛋白高，获得的水解物分子量最小为655.3 Da；以InSP为底物，考察不同条件对SI、腹腔巨噬细胞吞噬能力与DH的影响，研究发现在60℃获得的酶解物的DH最高，此时SI值与吞噬能力也最强。

2 免疫活性肽的分离纯化

酶法制备的活性肽中，因蛋白酶酶切位点具有一定的随机性和不确定性，导致酶解过程中产生了大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。因此，要对酶法制备的活性肽进行生物活性、结构及其构效关系的研究，就必须对酶解产物进行分离纯化，以富集得到较高纯度的生物活性肽。

在生物活性肽常用的分离纯化方法中，膜分离、等电点分离、离子交换树脂分离和亲和色谱分离已在工业化生产中得到了较广泛的应用，凝胶色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管色谱、高压液相色谱、质谱等分离技术则在实验室规模上得到了较普遍的使用。

2.1 膜分离

鉴于目前国内外研究［6］报道的免疫活性肽的相对分子量大多在2 k Da以下，因此，按分子量对肽进行分离纯化是一种有效可行的方法，并且适用于工业化生产。膜分离技术基于膜本身孔径的大小，比其孔径大的物质被截留在膜上，而直径较孔径小的物质可以透过膜，依据此原理可对不同分子量大小的活性肽进行分离纯化。

Bingjun Qian等［28］采用超滤膜对乳酸杆菌发酵液进行分离纯化，研究发现当肽的分子量范围为3～5 k Da时，其抗氧化活性比较高；继续分离纯化则可得到一个具有免疫活性的F6组分，此组分对小鼠脾淋巴细胞增殖指数为0.729。Milda Stuknyte等［29］采用超滤膜按分子量大小对牛乳乳酸菌发酵液进行分离纯化，研究发现分子量小于3 k Da的分离组分能显降低Caco－2细胞中NF－κB因子的活性，具有免疫调节的作用。

2.2 色谱分离

2.2.1 离子交换色谱分离 离子交换色谱的分离原理是基于活性肽带有不同性质电荷和不同电荷量，先使活性肽与带有相反电荷的离子交换剂结合，再通过电荷强度不同的洗脱液与活性肽竞争结合，从而将带有不同电荷量的物质分离开。离子交换色谱因成本低、效率高和易再生等特点而成为蛋白质和寡肽分离纯化中最常用手段，在蛋白质和寡肽纯化方案中的使用率达到75%左右，工业化应用前景良好。

房新平等［30］以体外淋巴细胞增殖活性为考察指标，采用DEAE Sepharose CL－6B阴离子交换色谱、凝胶色谱和反相高效液相色谱对牛胎盘蛋白胰蛋白酶酶解物进行分离纯化，牛胎盘免疫活性肽含量达93%，并经分离纯化获得氨基酸序列为 Tyr－X－Phe－Leu－Gly－Leu－Pro－Gly－X－Thr的免疫活性肽。张亚飞等［31］利用离子交换色谱法对小麦蛋白碱性蛋白酶酶解物进行分离，研究结果表明使巨噬细胞增殖效果较好的是p H 8与p H 10的洗脱组分。吴绵斌等［32］采用阴离子和阳离子两种交换色谱对小牛胸腺酶解物进行分离纯化得到的组分具有较高的肽含量。

2.2.2 大孔吸附树脂色谱分离 大孔吸附树脂的分离原理是基于吸附和分子筛，主要是通过分子间作用力如范德华引力或氢键等对被吸附的分子进行吸附，吸附剂表面的亲水或疏水性质决定了其具有不同的吸附特性；同时本身的多孔性结构亦决定其具有一定的分子筛作用。因树脂与被分离成分之间的吸附为物理吸附，被吸附的活性肽较易洗脱，因而具有成本低、效率高、稳定性好和易再生等特点。

侯虎等［33］比较了6种大孔吸附树脂对鳕鱼免疫活性肽的分离效果，其中DA201－C树脂对鳕鱼免疫活性肽的吸附能力最强，其吸附率、脱盐率与回收率分别为84.7%，98.1%，90.3%，脱盐后的鳕鱼免疫活性肽对小鼠脾淋巴细胞增殖能力有剂量依赖性。

2.2.3 凝胶色谱分离 凝胶色谱是利用凝胶的网状结构，据分子大小、形状差异进行分离的方法。凝胶色谱因具有设备简单、操作方便、分离条件温和、重复性好和样品回收率高等特点而广泛应用于活性肽的分离纯化，但因上样量小，只适合在活性肽分离纯化后期使用。纪丽娜［34］以小鼠脾淋巴细胞增殖指数为考察指标，采用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G－25与Sephadex G－15对分子量范围为5～10 k Da的金枪鱼头酶解物进行分离纯化，获得3个洗脱峰，研究结果显示TIP3C组分主要由200～800 Da的肽构成，低剂量的金枪鱼头酶解物即可显著促进细胞增殖和增强巨噬细胞吞噬能力。Assad Sila等［35］联用凝胶过滤色谱Sephadex G－25、反相高效液相色谱（RP—HPLC）与电喷雾质谱（ESI）对碱性蛋白酶鱼蛋白酶解物进行分离纯化，在一个活性较高的组分中检测出具有 抗 菌 活 性 的 3 条 肽 Ala－Ala－Ala－Leu、Ala－Ala－Gly－Gly－Val和 Ala－Ala－Val－Lys－Met。

Hu Hou等［24］以淋巴细胞增殖活性为指标，采用离子交换色谱、凝胶过滤色谱与RP—HPLC对阿拉斯加鳕鱼胰蛋白酶酶解物进行分离纯化，获得 Asn－Gly－Met－Thr－Tyr、Asn－Gly－Leu－Ala－Pro与 Trp－Thr 3条肽，其淋巴细胞增殖活性分别为35.92%，32.96%，31.35%。

2.3 电泳分离

电泳法分离蛋白质、肽、氨基酸等两性物质能得到较纯的组分，但处理量较小，不适用于工业化生产。常规Tris－Glycine－SDS－PAGE对10 kDa以下的小分子肽分辨率低，并且易出现扩散丢失和无着色带等现象。Schagger等［36］用Tricine代替传统甘氨酸，在常规SDS—PAGE分离胶与浓缩胶基础上增加一层间隙凝胶，并减小电流、延长电泳时间，实现了对5～20 k Da肽段的分离，并能观察到不太清晰的1 kDa肽段的色带。曹佐武［37］采用5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶，并在分离胶中加入尿素，发现1 kDa的小分子肽段的带型也能清晰显示。

3 免疫活性肽的作用机制

免疫系统由非特异性免疫与特异性免疫组成，非特异性免疫是多细胞生物经过进化形成的防御系统，它由皮肤黏膜组织、巨噬细胞、NK细胞等组成，是机体抵抗和消灭抗原的第一战线；特异性免疫是随着机体的个体发育，与抗原接触后获得的防御功能，它包含体液免疫和细胞免疫。免疫活性肽可以促进淋巴细胞的增殖、提高巨噬细胞活性、增强自噬细胞（NK）机能、促进细胞因子生成［2，38］等，通过这些功能来巩固机体防御能力、提高机体免疫力。

3.1 免疫活性肽与非特异性免疫

3.1.1 免疫活性肽与巨噬细胞 巨噬细胞是非特异性免疫的重要组成部分，巨噬细胞存在于各种器官和组织中，它能无特异性的识别抗原，释放出大量的细胞因子IL－1、IL－6、IL－8与TNF－α等，激发免疫反应。同时巨噬细胞能活化增殖、吞噬并消化抗原，也能将抗原传递给T淋巴细胞与B淋巴细胞，进入细胞免疫阶段。

龚吉军等［39］采用环磷酰胺构建小鼠免疫力低下模型，研究了油茶粕多肽对小鼠免疫能力的影响，发现油茶粕多肽能增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，减轻小鼠耳肿胀度，提高小鼠的免疫功能。Berthaou等［40］用合成的α－乳白蛋白免疫活性肽Gly－Leu－Leu研究其对小鼠的体液免疫活性，发现此3肽能显著促进巨噬细胞吞噬绵羊红细胞的能力，并能保护小鼠抵抗肺炎克雷伯氏菌的感染。Gattegno等［41］还发现此3肽能剂量依赖性地促进人单核巨噬细胞与衰老的红细胞的结合，并增强此类巨噬细胞的吞噬能力。

3.1.2 免疫活性肽对自然杀伤NK细胞的作用 NK细胞是人体体液免疫的第一道防线，属于非特异性免疫的范畴，它能分泌胞毒因子、肿瘤促死因子与穿孔素等，选择性地杀死靶细胞。NK细胞较T淋巴细胞、B淋巴细胞来说其特异性识别功能是较弱的。通常可从NK细胞生物活性变化来考察机体免疫功能。周涌等［42］采用蛙皮生物活性肽作用于小鼠，通过NK细胞增殖试验、变态反应和碳廓清试验考察哺乳动物细胞的免疫功能，发现蛙皮活性肽可明显促进NK细胞的免疫活性，NK细胞活性为77.4%。傅炜昕等［43］采用凝胶过滤层析与阴离子交换色谱分离纯化低分子地龙肽，并考察分离组分对自然杀伤NK细胞活性的影响，发现分子量在13 kDa以下的组分能明显提高NK细胞活性和杀伤率。

3.2 免疫活性肽与特异性免疫

3.2.1 免疫活性肽与T细胞 T细胞表面有能识别“非己”的抗原决定簇，这些抗原决定簇由糖蛋白组成，具有特异性的识别功能。T细胞的主要功能是介导细胞免疫，T细胞能消灭一些被感染的细胞，提高其他细胞的免疫作用与释放记忆细胞，抵御抗原的再次入侵。张智宇等［44］采用胰蛋白酶酶解豆粕，考察酶解工艺参数与小鼠T淋巴细胞增殖指数之间的关系，研究发现在一定的剂量关系内，豆粕酶解物对小鼠T淋巴细胞有显著增殖作用，刺激指数为1.189 4。Javier Rodríguez－Carrio等［45］采用膜过滤对β－乳球蛋白酶解物进行分离纯化，研究发现富集大量酸性氨基酸的组分能诱导Th1应答，分子量较小的组分能刺激单核细胞分泌TNF－α，另一个分子量较小的组分还能引导TGFβ分泌与调控T细胞分化，可能是由于从β－乳球蛋白获得的段能削弱过敏与炎症反应。

3.2.2 免疫活性肽与B细胞 B淋巴细胞是从骨髓干细胞分化而来的，属于体液免疫细胞，主要分布在淋巴结和脾脏中。当B细胞受到外界刺激时，能够分化成为浆细胞，浆细胞可以产生抗体，参与体液免疫；也可以分化为记忆细胞。刘宾等［46］用计算机推测大豆蛋白酸性多肽具有刺激B细胞抗原表位的结构，并能引起B细胞产生特异性免疫，从而激活体液免疫。方廖琼［47］研究了羊胎盘免疫调节肽GPIF对体液免疫的影响，发现GPIF能显著促进B细胞增殖与抗体分泌，提高脾淋巴B细胞与骨髓B细胞数量，促进骨髓干细胞向B淋巴细胞分化，表明GPIF具有促进小鼠体液免疫的能力；GPIF还能促进60Co－γ射线免疫损伤小鼠免疫功能的恢复。

4 展望

免疫活性肽的主流制备方法为酶解法，因蛋白酶酶切位点具有一定的随机性和不确定性，导致酶解过程中产生大量分子量大小相近但氨基酸序列不同的肽段。酶解产物是由蛋白质、肽和氨基酸混合的复杂体系，这大大增加了工业化生产和实验室分离纯化免疫活性肽的成本，选择高效率、低成本的分离纯化方法已成为酶法制备的免疫活性肽大规模工业化生产的关键所在。

免疫涉及到机体的体液、组织和器官，且各免疫细胞之间还将直接或间接的依靠多种信号分子进行信息传递，因而导致不同免疫活性肽作用的方式也各不相同，这使得免疫活性肽作用机制的研究变得更为复杂，目前还没有研究开发出简便有效的免疫活性评价方法。因此，进一步探索免疫活性肽的作用机制，揭示免疫活性肽功能与活性之间的关系，可为免疫活性肽类功能性食品的研究开发提供重要的理论依据。

1 Fitzgerald R J，Murray B A.Bioactive peptides and lactic fermentations［J］.International Journal of Dairy Technology，2006，59（2）：118～125.

2 Horiguchi N，Horiguchi H，Suzuki Y.Effect of wheat gluten hydrolysate on the immune system in healthy human subjects［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2005，69（12）：2 445.

3 Werner G H，Floc＇h F，Migliore－Samour D，et al.Immunomodulating peptides［J］.Experientia，1986，42（5）：521～531.

4 Agyei D，Danquah M K.Rethinking food－derived bioactive peptides for antimicrobial and immunomodulatory activities［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2012，23（2）：62～69.

6 吕学泽，王雪敏，梁玉荣，等.免疫活性肽的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2011，38（4）：170～172.

7 张贵川，袁吕江.食源性生物活性肽的研究进展［J］.中国粮油学报，2009（9）：157～162.

8 王秋韫，庞广昌.免疫活性肽的研究进展与展望［J］.食品科学，2002，23（7）：136～139.

9 程云辉，曾知音，郭建伟，等.抗氧化肽的酶法制备及其构效关系的研究进展［J］.食品与机械，2009，25（6）：174～180.

10 Staroscik K，Janusz M，Zimecki M，et al.Immunologically active nonapeptide fragment of a proline－rich polypeptide from ovine colostrum：amino acid sequence and immunoregulatory properties［J］.Molecular immunology，1983，20 （12）：1 277～1 282.

11 Gill H S，Doull F，Rutherfurd K J，et al.Immunoregulatory peptides in bovine milk［J］.British Journal of Nutrition，2000，84（S1）：111～117.

12 Meisel H，FitzGerald R J.Opioid peptides encrypted in intact milk protein sequences［J］.British Journal of Nutrition，2000，84（S1）：27～31.

13 Lai Y，Gallo R L.AMPed up immunity：how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense［J］.Trends in immunology，2009，30（3）：131～141.

14 Hancock R E W，Sahl H G.Antimicrobial and host－defense peptides as new anti－infective therapeutic strategies［J］.Nature biotechnology，2006，24（12）：1 551～1 557.

15 Easton D M，Nijnik A，Mayer M L，et al.Potential of immu－nomodulatory host defense peptides as novel anti－infectives［J］.Trends in biotechnology，2009，27（10）：582～590.

16 Jollès P，Caen J P.Parallels between milk clotting and blood clotting：opportunities for milk－derived products［J］.Trends in food science ＆technology，1991（2）：42～43.

17 Kayser H，Meisel H.Stimulation of human peripheral blood lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milk proteins［J］.FEBS letters，1996，383（1）：18～20.

18 Duarte J，Vinderola G，Ritz B，et al.Immunomodulating capacity of commercial fish protein hydrolysate for diet supplementation［J］.Immunobiology，2006，211（5）：341～350.

19 丁进锋，苏秀榕，李妍妍，等.海蜇胶原蛋白肽的免疫活性的研究［J］.水产科学，2011，30（6）：359～361.

20 Takahashi M，Moriguchi S，Yoshikawa M，et al.Isolation and characterization of oryzatensin：a novel bioactive peptide with ileum－contracting and immunomodulating activities derived from rice albumin［J］.Biochemistry and molecular biology international，1994，33（6）：1 151～1 158.

21 陈季旺，陶冠军，姚惠源，等.米糠类阿片拮抗肽的氨基酸序列分析［J］.食品科学，2005，26（12）：107～110.

22 房新平.牛胎盘免疫活性肽提取与酶法制备研究 ［D］.无锡：江南大学，2007.

23 Hou H，Fan Y，Li B，et al.Purification and identification of immunomodulating peptides from enzymatic hydrolysates of Alaska pollock frame［J］.Food Chemistry，2012，134（2）：821～828.

24 Ma J J，Mao X Y，Wang Q，et al.Effect of spray drying and freeze drying on the immunomodulatory activity，bitter taste and hygroscopicity of hydrolysate derived from whey protein concentrate［J］.LWT－Food Science and Technology，2014，56（2）：296～302.

25 马俪珍，甄润英，张建荣，等.具免疫活性的鲶鱼胶原多肽酶解工艺研究［J］.食品工业科技，2008（4）：152～155.

26 曾珍，李天歌，李诚，等.不同蛋白酶的兔骨酶解液对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用［J］.食品工业科技，2013，34（22）：310～314.

27 Kong X Z，Guo M M，Hua Y F，et al.Enzymatic preparation of immunomodulating hydrolysates from soy proteins［J］.Bioresource technology，2008，99（18）：8 873～8 879.

28 Qian B，Xing M，Cui L，et al.Antioxidant，antihypertensive，and immunomodulatory activities of peptide fractions from fermented skim milk with Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus LB340［J］.Journal of Dairy Research，2011，78（1）：72～79.

29 Stuknyte M，De Noni I，Guglielmetti S，et al.Potential immunomodulatory activity of bovine casein hydrolysates produced after digestion with proteinases of lactic acid bacteria［J］.International dairy journal，2011，21（10）：763～769.

30 房新平，夏文水，生庆海，等.多级色谱纯化牛胎盘免疫调节多肽及性质测定［J］.北京化工大学学报：自然科学版，2006，33（6）：42～45.

31 张亚飞，乐国伟，施用晖，等.小麦蛋白Alcalase水解物免疫活性肽的研究［J］.食品与机械，2006，22（3）：44～46.

32 吴绵斌，徐银君，孙明.胸腺肽β4分离与纯化工艺的研究［J］.中国新药杂志，2008，17（22）：1 945～1 947.

33 侯虎，赵雪，张朝辉，等.孔聚苯乙烯吸附树脂对鳕鱼排免疫活性肽的脱盐［J］.过程工程学报，2010，10（5）：899～904.

34 纪丽娜.金枪鱼头酶解物免疫活性肽的分离及对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响［D］.湛江：广东海洋大学，2012.

35 Sila A，Nedjar－Arroume N，Hedhili K，et al.Antibacterial peptides from barbel muscle protein hydrolysates：Activity against some pathogenic bacteria［J］.LWT－Food Science and Technology，2014，55（1）：183～188.

36 Schagger H，Jagow G.Tricine－sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa［J］.Anal Biochem.，1987（166）：368～379.

37 曹佐武.有效分离1 k Da小肽的Tricine－SDS－PAGE方法［J］.中国生物工程杂志，2004，24（1）：74～76.

38 Fitzgerald R J，Murray B A.Bioactive peptides and lactic fermentations［J］.International Journal of Dairy Technology，2006，59（2）：118～125.

39 龚吉军，黄卫文，钟海雁，等.油茶粕多肽对小鼠免疫调节功能的影响［J］.中国食品学报，2013（12）：21～27.

40 Berthou J，Migliore－Samour D，Lifchitz A，et al.Immunostimulating properties and three－dimensional structure of two tripeptides from human and cow caseins［J］.FEBS Letters，1987，218（1）：55～58.

41 Gattegno L，Migliore－Samour D，Saffar L，et al.Enhancement of phagocytic activity of human monocytic－macrophagic cells by immunostimulating peptides from human casein［J］.Immunology Letters，1988，18（1）：27～31.

42 周涌，杜鹃.林蛙皮生物活性肽对小鼠免疫功能的影响［J］.中国老年学杂志，2012，32（10）：2 107～2 108.

43 傅炜昕，董占双，李铁英，等.免疫活性地龙肽的制备及其对小鼠NK细胞活性的影响［J］.中国医科大学学报，2008，36（6）：650～652.

44 张智宇，朱秀清，任为聪.水解条件对挤压膨化高温豆粕酶解物免疫活性的影响［J］.食品科学，2011，32（21）：161～164.

45 Rodríguez－Carrio J，Fernández A，Riera F A，et al.Immunomodulatory activities of wheyβ－lactoglobulin tryptic－digested fractions［J］.International Dairy Journal，2014，34（1）：65～73.

46 刘宾，滕达，杨雅麟，等.大豆球蛋白A3酸性多肽的原核表达及B细胞表位分析［J］.中国食品学报，2012，12（3）：13～20.

47 方廖琼.羊胎盘免疫调节因子的免疫促进作用及其机理研究［D］.重庆：第三军医大学，2005.