禽流感诊断检测方法综述
2014-04-05王涌
王涌
禽流感诊断检测方法综述
王涌
(山东省昌乐县畜牧兽医局 262400)
禽流感(Al)又名真性鸡瘟、欧洲鸡瘟,是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)感染和疾病综合征。1878年首次发现于意大利,是人类最早发现的病毒,疾病之一。1955年Schafer首次证明其病原是A型流感病毒现在该病已遍布于世界上许多国家和地区,对世界养禽业的发展,甚至对人类的卫生健康都形成了一定的威胁,被国际兽疫局定为A类传染病。根据AIV对禽类致病性的差异,可将AIV分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。高致病性禽流感以突然死亡和高死亡率为特征,常可导致感染鸡群的全军覆没,造成严重的经济损失。而低致病性禽流感主要引起呼吸道症状,产蛋率、受精率及孵化率下降为主要特征。A型流感病毒每个核甘酸在每个复制周期中的突变机率大约是1.5×10-5,与其它RNA病毒的突变率相似。但是,由于流感病毒的基因组分为8个不同的片段,在病毒增殖过程中很容易发生基因重排,因而使流感病毒的抗原性和致病性很容易发生变异。因而检测流感病毒,有主与更好的了解流感的流行现状,并实施相应的疫苗接种来有效的防控。
1 血清学诊断技术
1.1 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI) AIV囊膜表面的血凝素能凝集多种动物的红细胞,这种凝集特性能被特异的血清抑制。血凝(HA)试验主要用于AIV的常规检测,血凝抑制(HI)试验可用于AIV的鉴定和血清中AIV抗体浓度的测定。HI试验具有较高的特异性和敏感性,但在做(HI)试验时,需要先去除血清中的非特异性的凝集因素,同时需要对抗原进行标准化,目前WHO一般采用此方法进行全球流感病毒的监测。
1.2 琼脂免疫扩散试验(AGP) AGP试验一般用来检AIV的共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有A型流感病毒的核蛋白以及基质蛋白都具有相似的抗原性,所以针对AIV的AGP试验都是检测这两类抗原的抗体。琼脂扩散试验操作简单,即可以定性又可以定量。1970年,Beard首次建立了用于禽流感抗原检测的AGP方法。AGP最常用的方法是免疫双扩散(IDD)。AGP检测抗核蛋白的抗体,既可以定量又可以定性,该方法操作简单,重复性好,敏感性强。
1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA具有较高的敏感性,既可以检测抗体,又可以检测抗原。尤其适合于大批样品的血清学调查,可以标准化而且结果易于分析。在H9禽流感的控制扑灭、检疫中广泛使用。1974年,Jennings等首先用ELISA方法对流感病毒免疫后抗体产生规律进行监测。之后,ELISA诊断方法的研究在国外发展很快。国内外大多采用间接ELISA和竞争ELISA检测鸡群抗体水平。李海燕等利用混和纤维素酯微孔滤膜建立了斑点ELISA,该方法不仅敏感性和特异性好,而且结果易于判定,非常适合现场H9N2亚型AIV抗体的检测及流行病学调查。此后又利用重组NP蛋白建立了间接ELISA,和免疫金标快速检测试纸条等。其他还有补体结合、神经氨酸酶活性抑制和单辐射溶血试验等。
2 分子生物学诊断技术
2.1 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 近几年来,随着现代生物技术的发展,分子生物学技术已被大量应用于禽流感的快速诊断。RT-PCR 是目前发展最成熟的分子诊断技术,是一种体外基因扩增技术,能在数小时内使DNA呈指数倍增加。可以从基因水平检测AIV的RNA,可以大大缩短对禽流感病原的检出时间,为禽流感的早期快速诊断提供了更敏感、更快速的方法。该技术具有高度的敏感性和特异性,可大大缩短对AIV的检出时间,不仅克服了病毒分离鉴定试验周期长的缺点,而且克服了因野外取材混有其他病毒造成的误诊,为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的检测方法。目前已引起国内外学者的广泛关注。利用RT-PCR方法鉴定H9N2亚型禽流感的是世界动物卫生组织(OIE)推荐的方法之一。
2.2 RT-PCR-ELISA法 Chaharaein等研究了用于快速检测H9N2亚型AIV的RT-PCR-ELISA法,与标准的病毒分离法以及血清学试验(血凝试验和血凝抑制试验)进行比较,基于H9亚型AIV的RT-PCR-ELISA 法对SPF鸡体内H9N2亚型AIV检测敏感性与病毒分离法相比达到100%,RT-PCR-ELISA的敏感性是凝胶电泳法的10倍,说明RT-PCR-ELISA 法对于检测A型流感病毒,特别是鸡体内H9N2亚型AIV 亚型是一个非常简便、敏感的方法。
2.3 胶体金免疫层析技术 20世纪80~90年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展了新型体外诊断技术--胶体金免疫层析技术(GICA)。GICA对样品要求不高,组织液、血清、粪便和尿液等均可十min即可出现结果,肉眼即可判断;准确可靠,特异性强,灵敏度高,可达到ELISA 水平;应用广泛,成本低,保存方便,更有利于临床现场检测使用。
2.4 荧光RT-PCR 荧光RT-PCR技术是20世纪90年代末才发展起来的新技术,是将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR仪中反应,电脑对整个反应进行实时监测,避免了交叉污染,与常规RT-PCR方法相比,其灵敏度和特异性都有所提高,对PCR产物无需进行后处理,缩短了检测时间。商品化试剂盒的问世,使该技术操作起来十分简单、方便。
随着时间的推移会有更简便、更高效、更准确的方法出现,但是对于疑似高致病性禽流感发病禽群要及时按照国家要求进行上报,在确诊后进行隔离禽场或禽舍,严禁将病禽或可疑病禽上市,病死禽必须深埋或焚烧。只有这样才能真正的控制流感的发生。
[1] 王重庆. 分子免疫学基础[M]. 北京: 北京大学出版社,1997, 223-225.
[2] 孙明, 李纯铃, 赵铁柱等. 禽流感病毒A型和H5亚型RT-PCR检测试剂盒研究[J]. 中国实验动物学报.
(2014–02–23)
S858.31
B
1007-1733(2014)05-0087-02