人参皂苷含量变化及其影响因素

卢 聪 鲍勇刚 石松传 William Jia 刘新民

(1中国医学科学院药用植物研究所，北京，100193;2北京博肽健诺威生物技术有限公司，北京，100085;3加拿大UBC大学，加拿大)

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国名贵中药材，为五加科人参属植物，阴生且生长缓慢，对生长环境要求较高。皂苷是人参主要的活性物质，研究表明，人参皂苷具有广泛的生理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抑制细胞凋亡等[1]。因此人参皂苷含量被认为是衡量人参内在质量的重要指标之一。而人参皂苷的含量因品种、部位、生长条件、采集时间以及炮制方法等不同而存在统计学意义;近年来，随着现代生物技术尤其是组学技术在人参研究中的广泛深入应用，人参皂苷合成相关的基因与蛋白组学的研究逐渐深入到人参研究中，而人参皂苷含量也与此类基因及蛋白表达的变化息息相关。本文从不同生长环境、皂苷合成相关基因及差异表达蛋白这三方面对人参皂苷含量变化的影响因素进行归纳整理，以期对人参皂苷含量相关研究提供有益的帮助。

1 人参皂苷及其含量变化

人参皂苷由糖的半缩醛羟基与非糖组分构成，属于三萜类化合物，其中非糖部分称为苷元。根据苷元化学结构的不同，人参皂苷分为两大类型，即达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷型为四环三萜类皂苷，齐墩果烷型为五环三萜类皂苷。达玛烷型人参皂苷依据糖基在碳骨架上的位置不同(C－3，C－6及C－20)被分为原人参二醇型(Protopanaxadiols，PPD)和原人参三醇(Protopanaxatriols，PPT)。二醇型达玛烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3和/或C－20位，包括Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg3，Rh2，Rh3;三醇型达玛烷皂苷中糖基位于苷元碳骨架的C－3、C－6和/或C－20位，包括 Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1。

1854年，Garriques等在进行西洋参化学成分研究时，最早分离出了含有皂苷成分的组分[2]。但直到1963年，日本学者Shibata才从人参根中分离鉴定出皂苷及其结构[3－4]，这些皂苷被称为人参皂苷。这之后，研究者们不断从人参根、茎、叶、花蕾、果实及种子中分离鉴定出各种皂苷成分，目前已经确认人参总皂苷是由100多种人参皂苷组成，其中已被分离并鉴定结构的皂苷达60 多种[1]。

不同的人参其皂苷含量是有差别的。何绍玉等[5]通过对林下山参和园参中人参皂苷含量的分析比较证实人参总皂苷的含量林下山参高于园参。荆淑芹等[6]采用高效液相色谱法对园参、林下参、红参三种人参的皂苷含量进行测定，发现园参与红参在皂苷Rg1、Re、Rb2含量上是有差异的，林下参中皂苷单体Re含量高于园参中，而林下参与红参在皂苷Rb2、Rf、Re以及皂苷总量上也是有差异的。赵亚会等[7]对浅橙果人参、深橙果人参、橙果人参、红果人参、黄果人参、大马牙类型人参、二马牙类型人参、圆膀圆芦类型、吉参一号以及长脖类型人参进行含量测定与分析，结果显示:在不同果实颜色的人参类型中，以纯色系类型红果和黄果人参的单体皂苷含量总和较高，且它们的单体皂苷Rg1含量也呈相同趋势。在以根部形态为分类特征的人参类型中，大马牙型人参中的Rg1含量最高。而人参不同部位的皂苷含量也有差异。Shi等[8]对5年生人参根、叶、根毛、根茎、茎的总皂苷和单体皂苷的量进行了比较，结果显示:总皂苷含量(mg/g)最高的是根毛(85.90)，最低的是茎(9.79)，仅次于根毛的是叶(69.85)、根茎(38.33)和根(36.41)。人参皂苷Re在人参叶和根毛中的量是人参皂苷Rg1在其中的5倍，但是在人参根中则低于人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd在人参根毛中的量最高，在人参茎中没有检测到Rb3和Rc。而李闯等[9]进行了更多不同人参部位皂苷含量的研究，结果显示:人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd在人参须根和支根中含量比其他部位均高;皂苷Rg1在叶和果肉中含量显著;此外Re在人参叶和果肉中含量均很高，约占总皂苷含量的50%。这两位的研究结果相类似，均提示研究者们除了人参根能得到完全利用外，人参的其他部位如叶和果肉亦含有丰富的皂苷成分，极具价值潜质，引导人们进行更加深入的人参不同部位皂苷成分和含量的研究工作。

2 不同生长环境对人参皂苷含量的影响

人参皂苷含量受多种因素影响，而由于诸如茎叶数、生育期、生长年限、土壤、施肥、光照、栽培方式、采收期等的不同，都使得不同产地的人参中总皂苷及单体皂苷的含量具有显著的差异[10]。张燕娣等[11]通过研究不同茎叶数人参在不同生育期的人参皂苷含量变化，发现单体皂苷和总皂苷的结果基本一致，从总皂苷和单体皂苷的结果看出人参皂苷含量:双茎叶＞三茎叶＞单茎叶即人参中皂苷含量随光合叶面积的变化而变化，而且在红果期的末期含量最高。Lee等[12]分析了4年生人参叶在受光率为5%、10%、20%、30%时人参根总皂苷量的差异，发现总皂苷量随受光率的增大而增加，而在30%受光率时略降低。Kim等[13]分析比较了光量子分别为 19、39、26、35 μmol/(s·m2)的蓝色、红色、1∶1蓝红混合光LED及荧光灯对2年生人参总皂苷量的影响，结果得出:总皂苷量(mg/g)由高到低的顺序为蓝色LED(46.1)＞荧光灯(45.3)＞1∶1蓝红混合光LED(40.2)＞红色LED(40.1)，但各种光源间无统计学意义。张兰兰等[14]通过分析不同年份(5～17年)林下山参叶中多个皂苷类成分的含量，考察年份对皂苷含量的影响，并与已有的研究报道作比较发现:5～17年林下山参叶皂苷成分随着生长年份增长大体上存在降低－升高－降低的变化过程，其中14年林下山参叶中的皂苷类成分含量最高，其各皂苷类成分含量均处于较高水平，尤其是人参皂苷Re和人参皂苷Rd，显著高于其他年份林下山参叶且其总皂苷成分含量最高。而同一批5～17年林下山参根部的皂苷类成分研究表明，5～10年根部皂苷类成分升高，随后降低，14年生林下山参总皂苷含量最低，16、17年生林下山参总皂苷含量又开始升高，与叶中的变化趋势相反。An等[15]对4月18日、5月15日、6月18日、8月18日、9月18日、10月18日采收的4年生人参的总皂苷和单体皂苷量进行了比较，结果显示:总皂苷量分别为 2.52%、4.09%、1.92%、2.14%、1.82%、1.75%，总皂苷量在5月15日最多，之后随采收期的延长而逐渐减少，且各采收期间具有显著差异;人参皂苷Re等7种单体皂苷量的变化趋势与总皂苷量的变化趋势相似，也在5月15日最多。孙海等[16]研究证实土壤养分影响人参皂苷的积累，其中土壤中有机质和全量氮、磷直接影响人参总皂苷的积累。土壤有机质是其他养分的来源，是微生物生存和繁衍的碳源和氮源，直接影响着土壤中速效养分的供给，而速效养分是人参完成正常生理代谢和进行次生代谢所必须的物质基础;氮和磷的含量则直接影响人参的次生代谢途径，影响人参皂苷的合成。Li等[17]对直播栽培与移植栽培5年生人参的总皂苷及单体皂苷量进行了比较，结果得出直播参的主根及支根的总皂苷量为23.8 mg/g、40.9 mg/g，高于移植参的 22.2 mg/g、35.7 mg/g，而须根则为移植参总皂苷量83.1 mg/g高于直播参78.8 mg/g，结合干物质量计算出的直播参与移植参的皂苷量分别为 722.1 mg、1142.9 mg;单体皂苷 Rb2、Rb3、Rf与测试的3个部位无关，直播参均高于移植参，而Rd和Rh1则相反，直播参均低于移植参。据此为了综合利用宝贵的人参资源，扩大人参具有药用价值的部位，合理进行人工种植和炮制等提供一定的参考，从多方位多因素进行更深入的皂苷含量的研究是十分必要的。

3 皂苷合成相关基因对人参皂苷含量的影响

根据国内外学者的研究，人参皂苷的生物合成步骤是在许多关键酶的共同作用下完成的，这些酶包括3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合成酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)、氧化鲨烯环化酶(OSCS)、β－香树素合成酶(β－AS)、达玛烷二醇合成酶(DS)、细胞色素 P450(CYP450)以及糖基转移酶(GT)。研究者们对人参皂苷合成中关键酶的基因进行分析研究发现，不同关键酶基因的变化与皂苷含量变化的相关性极高。蒋世翠等[18]在分析了4年生西洋参不同组织器官中总皂苷和单体皂苷量的差异及其与人参皂苷合成途径中鲨烯合成酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SQE)基因表达量之间的关系;这些组织器官分别是:须根、侧根、根皮(周皮和韧皮部)、根心(木质部)、芦头、茎、小叶柄、大叶柄、叶片、果茎、果柄、果肉、种皮、种仁。结果表明 SQS和SQE基因在14个组织器官中的表达量具有非常显著的差异(P＜0.01)并与人参皂苷 Re、Rg1、Rb1、Rd和总皂苷量之间有显著的正相关关系(P＜0.05)。

此外，提高或降低人参皂苷合成关键限速酶基因的表达，会极大影响人参中的皂苷含量。Lee等[19]将克隆分离出的鲨烯合成酶基因(PgSS1，AB115496)导入人参不定根中过量表达，发现七种人参皂苷(Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1)含量与未转基因植株相比均有所增加，人参总皂苷量是对照的3倍。Han等[20]利用RNAi技术研究了SQE基因在人参皂苷合成中的作用，通过HPLC检测发现SQE基因沉默后，人参总皂苷量降低了84.5%。Kim等[21]将人参的PgFPS转到积雪草毛状根中使其过量表达，发现积雪草达玛烷合酶的mRNA水平显著提高，三萜皂苷羟基积雪草苷和积雪草苷的产量瞬时升高。Han等[22]对茉莉酸甲酯诱导的人参不定根进行了转录组测序，得到9个候选CYP450全长基因。其中CYP716A47基因不仅可使得茉莉酸甲酯诱导表达量上调，而且转入过量表达SS基因的转基因人参植株后能使人参根中皂苷的产量提高。除上述相关研究外，3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因相关的转基因及基因敲除等研究未见相关报道，而近年来虽有关于糖基转移酶基因克隆的报道[23]，但迄今尚未有从人参属植物中克隆到GT基因及相关转基因等研究的报道。

4 人参中差异表达蛋白对皂苷含量的影响

随着蛋白质组学技术的不断成熟及广泛应用，除了皂苷代谢相关的酶类变化所导致的皂苷含量变化外，研究者们期望利用蛋白质组学技术鉴定其他与皂苷变化相关的差异表达蛋白。早期的人参蛋白组学分析多是对培养的人参须根进行，因为培养的人参须根作为研究材料有无法替代的优势。Kim等[24]使用2－DE技术从培养的人参须根中共分离出280个蛋白点，推测出其中159个蛋白的功能，最终确证91个。在这些确证功能的蛋白中，超过20%的蛋白参与能量代谢与应激反应，但是没有发现参与次级代谢产物生成的酶类。Lum等[25]同样用双向电泳技术，比较了人参四个不同部位主根、须根、芦头及参皮的蛋白差异，虽然没有特别突出的蛋白差异点出现，但是电泳图上相同蛋白点的排列模式却有显著差别。孙立伟等[26]分析园参芦头、主根、须根、表皮等4个不同部位的双向电泳图谱，发现了人参不同部位13个相同的蛋白点，并在主根中发现了2个特异点，在芦头和表皮中发现了1个特异点，在须根中发现了1组特异点群 (3个点)。Nam等[27]比较了在不同光照环境下，人参叶片的蛋白表达差异，鉴定出的蛋白点功能多与能量代谢、蛋白质稳定以及氧化应激保护等相关。Kim等[28]比较了培养的人参须根以及野生人参根中的蛋白差异，虽然有超过了90个共同的蛋白点，但是野生人参根中的表达蛋白依旧与培养的人参根须有很大的差异。而使用蛋白组学技术分析不同品种人参后，不同人参样品的2－DE电泳图间有明显的差别，能够用于不同人参品种的鉴别[29]。最近，Nagappan等[30]用2－DE技术比较分析了人参与印度参根中差异表达的蛋白，从电泳中分别挑出21个高丽参蛋白及35个印度参蛋白的序列进行质谱鉴定，并分别对其中14个和22个高丽参及印度参的蛋白功能进行确定，发现这些蛋白主要参与细胞代谢，防御以及次级代谢，但是共同参与睡茄内酯和人参皂苷生物合成的蛋白却没有发现。上述研究表明，虽然皂苷合成在人参生理代谢过程中属于次级代谢反应，但是其他人参生理代谢相关蛋白的变化对皂苷合成的可能影响不应忽略。遗憾的是，即便不同环境下的人参中诱导表达的蛋白是显著不同的，但未鉴定出与人参皂苷合成直接相关的差异表达蛋白。

5 展望

人参皂苷产量低、活性高，为满足日益增长的产业化需求，因此人参皂苷含量变化的研究也不断向纵深发展。现代生物技术的应用尤其是以基因组及蛋白质组学技术为代表的组学技术的广泛应用，使得人参皂苷含量变化相关的研究取得了很大的进展但也存在着一些问题，如不同生境下人参皂苷含量变化的机理研究尚需深入;缺乏有效的人参组培体系从而限制人参转基因研究的开展，人参基因组数据库的缺乏成为制约发现、鉴定差异表达蛋白的主要因素等。相信随着人参基因组测序工作的展开，以及代谢组、转录组等新技术的广泛深入应用，人参皂苷含量变化相关的研究工作将进入更加全面的发展时期，也必将对人参产业的发展带来深远影响。

[1]Lu JM，Yao QZ，Chen QY.Ginseng Compounds:An Update on Their Molecular Mechanisms and Medical Applications[J].Curr Vasc Pharmacol，2009，7(3):293 –302.

[2]Garriques SS.On panaquilon，a new vegetable substance[J].Ann Chem Pharm，1854，90:231－234.

[3]Shibata S，Ando T，Tanaka O，et al.Saponins and sapogenins of Panax ginseng C.A.Meyer and some other Panax spp[J].Yakugaku Zasshi，1965，85:753－755.

[4]Shibata S，Tanaka O，Soma K，et al.Studies on saponins and sapogenins of ginseng[J].The structure of panaxatriol.Tetrahedron Lett，1965，42:207－213.

[5]何绍玉，李伟，郑毅男，等.林下山参与园参中腺苷和人参皂苷含量比较分析[J].药物分析杂志，2010，30(9):1701－1706.

[6]荆淑芹，姜海平，刘凤云.生晒参、红参、林下参中7种人参皂苷含量的比较[J].中华中医药学刊，2009，27(1):207－209.

[7]赵亚会，司方方，吴连举，等.人参、西洋参部分种质资源的单体人参皂苷测定分析[J].特产研究，2006，28(2):67－70.

[8]Shi W，Wang YT，Li J，et al.Investigation of ginsenosides in different parts and ages of Panax ginseng[J].Food Chem，2007，102:664－668.

[9]李闯，王义，张美萍，等.人参不同部位皂苷成分的HPLC测定[J].吉林中医药，2010，30(4):347－349.

[10]李翔国，全炳武，李虎林，等.人参皂苷量变异的研究进展[J].中草药，2012，43(11):2300－2304.

[11]张燕娣，吴俊，李哲，等.不同生育期光合叶面积对人参皂苷含量的影响[J].中国农学通报，2012，28(19):233－239.

[12]Lee JC，Choi JH，Cheon SK，et al.Studies on the optimum light intensity for growth of Panax ginseng II.Effect of light intensity on the contents of saponin and free sugar in the ginseng leaf[J].Korean J Crop Sci，1983，28(4):497－503.

[13]Kim MJ，Li XG，Han JS，et al.Effect of blue and red LED irradiation on growth characteristics and saponin contents in Panax ginseng C.A.Meyer[J].Korean J Med Crop Sci，2009，17(3):187－191.

[14]张兰兰，高文远，宋兆辉，等.不同年份林下山参叶中皂苷类成分含量变化研究[J].中国中药杂志，2012，37(17):2530－2533.

[15]An YN，Lee SY，Choung MG，et al.Ginsenoside concentration and chemical component as affected by harvesting time of four－year ginseng root[J].Korean J Crop Sci，2002，47(3):216－ 220.

[16]孙海，张亚玉，孙长伟，等.不同生长模式下人参土壤养分状况与人参皂苷含量的关系[J].西北农业学报，2012，21(8):146－152.

[17]Li XG，Kan SJ ，Han J S，et al.Comparison of growth increment and ginsenoside content in different parts of ginseng cultivated by direct seeding and transplanting[J].Korean J Med Crop Sci，2010，18(2):70－73.

[18]蒋世翠，刘伟灿，王义，等.西洋参不同器官中皂苷量与鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶基因表达的相关性[J].中草药，2011，42(3):579－584.

[19]Lee MH，Jeong JH，Seo JW，et al.Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene[J].Plant Cell Physiology，2004，45(8):976 ～984.

[20]Han JY，In JG，Kwon YS，et al.Regulation of ginsenoside and phytostero biosynthesis by RNA interferences of squalene epoxidase gene in Panax ginseng[J].Phytochemistry，2010，71:36－46.

[21]Kim OT，Kim SH，Ohyama K，et al.Upregulation of phytosterol and triterpene biosynthesis in Centella asiatica hairy roots overexpressed ginseng farnesyl diphosphate synthase[J].Plant Cell Rep，2010，29:403－ 411.

[22]Han JY，Kim HJ，Kwon YS，et al.The Cyt P450 enzyme CYP716A47 catalyzes the formation of protopanaxadiol from dammarenediol－II during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng[J].Plant Cell Physiol，2011，52:2062－2073.

[23]Chen X，Xue Y，Liu JH，et al.Purification and characterization of glucosyltransferase from Panax Ginseng hairy root cultures[J].Pharm Biotechnol，2009，16:50－54.

[24]S.I.Kim，J.Y.Kim，E.A.Kim，et al.Proteome analysis of hairy root from Panax ginseng C.A.Meyer using peptide fingerprinting，internal sequencing and expressed sequence tag data[J].Proteomics，2003，3:2379－2392.

[25]John Hon－ Kei，Lum，Ka－ Lee，Fung，Pik－ Yuen ，et al.Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C.A.Meyer and the potential to use it as an identification tool[J].Proteomics，2002，2:1123 – 1130.

[26]孙立伟，马朋涛，麻锐，等.园参根不同部位双向电泳图谱的比较分析[J].华中师范大学学报:自然科学版，2010，44(4):639－643.

[27]Myung HN，Eun JH，Jin YK，et al.Proteome analysis of the responses of Panax ginseng C.A.Meyer leaves to high light:Use of electrospray ionization quadrupole－time of flight mass spectrometry and expressed sequence tag data[J].Proteomics，2003，3:2351 – 2367.

[28]S.I.Kim，S.M.Kweon，E.A.Kim，J.Y.Kim，S.Kim，J.S.Yoo，Y.M.Park[J].Plant Physiol，2004，161:837.

[29]John Lum，Ka－ Lee Fung，Pik－ Yuen Cheung，et al.Proteome of Oriental ginseng Panax ginseng C.A.Meyer and the potential to use it as an identification tool[J].Proteomics，2002，2:1123 – 1130.

[30]Nagappan A，Karunanithi N，Sentrayaperumal S，etal.Comparative root protein profiles of Korean ginseng(Panax ginseng)and Indian ginseng(Withania somnifera)[J].Am J Chin Med，2012，40(1):203－218.