凝血酶在脑出血中的作用研究现状

王 亮，张建富，刘海珠

(威海市立医院，山东威海264200)

凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶，主要产生于高血压脑出血、颅内动脉瘤、动静脉畸形(AVM)破裂出血、颅脑外伤等患者的脑组织中。脑出血为神经外科常见病，但目前尚无有效治疗方法。多项研究已证实，凝血酶在脑出血后神经损害和脑水肿的发生机制中扮演重要角色。现将凝血酶在脑出血中的作用研究现状综述如下。

1 凝血酶的结构、生物学特性及来源

1.1 凝血酶的组成及结构 人体凝血酶由259个氨基酸残基的重链B和49个氨基酸残基的轻链A构成，其中重链B具有三个功能结构区和酶活性位点，构成凝血酶的三个功能结构区:一是精氨酸侧链口袋，其催化位点由Asp-102、His-47和Set-195构成;二是非极性结合位点，可与底物发生疏水作用;三是阴离子结合位点，可能由重链B的6个赖氨酸组成，主要与凝血酶调解蛋白、血小板受体等相互作用、相互识别［1］。

1.2 凝血酶的生物学特性 凝血酶多产生于局部受损的血管，能将无活性的纤维蛋白原变为有活性的纤维蛋白，并引发诸多受体介导的过程，如平滑肌收缩、血栓素形成及血小板聚集分泌［2］;还能与内皮细胞相互作用，促进内皮源性松弛因子、前列腺素、内皮素等物质释放。凝血酶的凝血原理为首先通过始动因子(血级联反应)激活Ⅹa因子，将无活性的凝血酶原激活成具有活性的凝血酶，其后介导Ⅷa因子转化成Ⅺ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅷ的负反馈激活及纤维蛋白原转变成纤维蛋白的过程，进而激活血小板。

1.3 凝血酶的产生途径 凝血酶原是一种主要由人体肝脏合成、以微分子水平存在于血浆中的物质。Ⅴa凝血因子可以借助外源性或者内源性凝血途径产生，并将凝血酶原转化成凝血酶。由于1 mL全血能形成1.5 nmol凝血酶，发生脑损伤或脑出血的患者会出现实质性脑损害，继而导致凝血酶原发生裂解产生大量的凝血酶。因此，凝血酶既可来自脑组织自身，也可以产生于局部损伤部位。体外相关研究［3］证实，凝血酶原mRNA可在脑胶质源性和组织神经元的细胞系中表达，脑部有缺血损害者脑凝血酶原mRNA表达也会有所上调，提示在脑中存在ⅩamRNA的情况下，即使血脑屏障(BBB)未遭到破坏，凝血酶依然能形成和导致脑损害。但以上作用反应的机制尚不清楚。

1.4 凝血酶与凝血酶受体(TR) 凝血酶主要通过与TR结合发挥作用。TR是蛋白酶激活受体，由包括胞内环状结构(3个)和胞外环状结构(3个)等在内的7个疏水跨膜区域构成，其末端氨基延伸到了细胞外，其中有与凝血酶阴离子结合位点相结合的序列LDPR/SFLL和识别凝血酶的序列KYEPFWEDEE。以上两个结构相互作用可使TR的第41位和42位氨基酸发生裂解，形成新的氨基末端(起始序列为SFLLRN)。在神经系统中，凝血酶可与暴露受体外功能区的配基序列及自身的配基袋相互作用，促进细胞活化、引起其他相关变化［4，5］。

2 凝血酶在脑出血后病变发生中的作用

2.1 脑组织毒性 Lee等［6］运用立体定向注入的方法，分别向大鼠右侧基底节注入浓缩血细胞、血清、血浆、全血，24 h后处死动物并测量其脑内离子含量及水肿程度，结果发现全血组的离子含量未改变、脑水肿量与脑含水量增加值一致。提示脑水肿的发生和血浆、血清及浓缩血细胞无必然关系，血浆中加入一定量的凝血酶原也可引发脑水肿。另有研究［7］显示，将凝血酶抑制剂alpha-NAPAP注入到凝固血块中能明显减轻脑内血肿肿块边缘水肿，但无法改变血肿的原有容积。表明凝血酶的化学刺激作用大于血凝块的机械压迫作用。Xi等［8］发现，大鼠脑出血后脑水肿未达高峰前，右侧基底节注入凝血酶后24～48 h脑水肿达到高峰;而注入浓缩红细胞后2 d内亦无明显脑水肿迹象，但3 d后脑组织含水量明显增加。提示凝血酶在早期脑水肿发生中起作用，而红细胞则在晚期脑水肿发生中起作用，二者起效时间不同。凝血酶的神经毒性作用主要体现在以下几个方面:①注入基底节区后可引起脑水肿;②血凝块中凝血酶原转化成凝血酶的数量随脑水肿程度加强而逐渐增加;③特异性凝血酶抑制剂对脑出血后脑水肿形成有抑制和减弱作用。实验表明，凝血酶浓度为l U/mL时可增加脑组织水含量，10 U/mL时会明显增加患者病死率。另有研究［9］表明，脊髓和脑组织中存在很多凝血酶结合位点，凝血酶浓度在50 pmol/L～50 nmol/L时可有效保护脑细胞，＞50 nmol/L时则会损伤脑细胞;对于脑内血肿，用小剂量凝血酶进行预处理可缩小缺血范围［10］，保护脑细胞、减小脑血肿体积［11］。同时，小剂量凝血酶还能激活神经细胞及神经胶质细胞上的TR、阻止细胞凋亡。

2.2 引发脑水肿 凝血酶引发脑水肿的途径包括血管源性和细胞毒性两种，前者主要发生在脑出血24 h后，因正常生理状态下BBB阻止了部分大分子物质通过血管壁进入脑组织，一旦血管的通透性增强，血浆成分会经由血管壁渗出，进入到脑组织间隙后引发血管源性脑水肿［12］;后者主要发生于脑出血后24 h内，由凝血酶破坏BBB所致。凝血酶特异性抑制剂水蛭素能明显减轻脑水肿程度。研究表明，通过肝素化保持自体血液不凝固引发的脑水肿与其他性质脑水肿不同，表现为24 h内血肿周围未出现水肿。血细胞膜上磷脂的实际释放速度可能会控制凝血酶原转化为凝血酶的进程，并控制凝血酶的实际释放速度，整个控制过程达数小时，即血细胞破坏的速度会直接影响凝血酶产生速度。因此，脑部受损后的第一个24 h内，脑细胞破坏率增加促进产生更多的凝血酶、引起磷脂聚集增加，从而加重脑水肿;而脑水肿和脑细胞死亡是因为大剂量凝血酶(＞5 U)破坏BBB引起，提示凝血酶是一种神经毒性介质［13］。水通道蛋白4(AQP-4)是脑组织中分布最广、含量最多的水通道蛋白。凝血酶可上调AQP-4表达，进而增加水分子快速跨膜转运，从而加重脑水肿;向脑内注射一定量凝血酶可增加注射点周围组织AQP-4表达，且其表达变化与脑组织含水率变化一致［14］。

2.3 破坏BBB Lee等［6］发现，在大鼠基底节区注射凝血酶后3H标记的α-氨基异丁酸表达升高，认为凝血酶可破坏BBB、引发脑细胞死亡，但通常不影响脑血流。因此，脑水肿形成的诱因为BBB破坏和凝血酶的神经毒性作用;凝血酶还可剂量依赖性增加血管内皮细胞层通透性。Nagy等发现，在体外培养液中加入凝血酶后人脑微血管内皮细胞立即收缩、细胞间隙扩大，去除凝血酶后半小时细胞恢复正常形态，认为上述变化是凝血酶改变了BBB的通透性所致;早期脑水肿可由细胞毒性引发，后期则是由BBB遭到破坏所致。基质金属蛋白酶(MMP)能分解细胞外基质、破坏脑细胞的基底膜，从而破坏BBB的完整性;对于高血压脑出血患者，凝血酶可能通过激活血管内皮细胞和巨噬细胞，使MMP-9、MMP-2表达增加，进而损坏BBB的完整性［15］。

2.4 脑血管毒性 脑血管容易受到凝血酶的双重作用。低浓度凝血酶的内皮依赖性和快速减敏作用可引起血管扩张，可能机制为内皮细胞受刺激后产生内皮源性舒张因子［16］，激活血管平滑肌细胞中鸟苷酸环化酶，使cGMP浓度升高、平滑肌松弛;高浓度凝血酶则可使血管发生持久而缓慢的收缩，细胞外钙离子浓度变化可能与此有关。高血压患者发生脑出血后，血肿周围脑组织的血流短暂下降，且血流速度与肿块大小有关;脑缺血的程度与时间决定高血压脑出血后脑梗塞程度;猴类脑组织血流下降至10～12 mL/(100 g·min)数小时后才会慢慢出现脑梗塞，血流长时间维持在25 mL/(100 g·min)时则不会出现脑梗塞。因此，人脑出血后局部脑血流下降可能与凝血酶无明显相关。

3 抗凝血酶治疗在脑出血中的应用

3.1 内源性凝血酶抑制剂 抗凝血酶治疗对脑出血预后有积极意义，内源性凝血酶抑制剂主要包括纤溶酶原激活物抑制剂1和蛋白酶连接素1等。其中蛋白酶连接素1为脑内所特有的高效凝血酶抑制剂，主要由脑内胶质细胞分泌，可与凝血酶形成复合物后结合于胶质细胞表面。纤溶酶原激活物抑制剂1主要由内皮细胞分泌，在脑组织内广泛表达，能快速、高效抑制纤溶酶原激活物及尿激酶，其在高血压脑出血后患者体内的水平变化与凝血酶有关［17］，且可通过拮抗凝血酶的毒性作用保护脑组织。研究［18］发现，大脑中动脉阻塞患者纤溶酶原激活物抑制剂1水平显著降低，可用于指导溶栓药物的安全应用。

3.2 外源性凝血酶抑制剂 主要包括alpha-NAPAP(人工合成)、水蛭中提取的水蛭素和肝素等。肝素抑制凝血酶的机制有三种:一是与凝血因子Ⅲ结合形成复合物，抑制凝血酶及其他凝血因子;二是与阴离子结合位点和凝血酶的催化位点结合;三是可能增强脑内纤溶酶原激活物抑制剂1和蛋白酶连接素1的作用。水蛭素是从天然水蛭中提取的、目前作用最强的凝血酶特异性抑制剂，可通过非共价键与凝血酶的催化位点及阴离子外位点结合。目前，人们已经合成了多种凝血酶的抑制剂。

综上所述，凝血酶在脑出血后脑水肿等病变发生中具有一定作用，但其毒性作用的分子机制尚不明确;抗凝血酶治疗可能是防治脑出血后继发性脑损伤的有效措施之一。

［1］Di Cera E，Cantwell AM.Determinants of thrombin specificity［J］.Ann N Y Acad Sci，2001，936(1):133-146.

［2］Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are assaciated with early growth of intracerebral hemorrhage molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2005，36(1):86.

［3］Reymann KG.Increase of prothrombin-mRNA after global ischemia in rats，with constant expression of protease nexin-1 and proteaseactivated reception［J］.Neurosci Lett，2002，329(2):181-184.

［4］Gabazza EC，TaguchiO，Kamada H，etal.Progress in the understanding of protease-activated receptors［J］.Int JHematol，2004，79(2):117.

［5］Kawabata A.Gastrointestinal functions of protease-activated receptors［J］.Life Sci，2003，74(2-3):247.

［6］Lee KR，Betz AL，Kim S，et al.The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage［J］.Acta Neurochir(Wien)，1996，138(4):396-400.

［7］XiG，Keep RF，Hoff JT.Erythrocytes and delayed edema formation following intracerebral hemorrhage in rates［J］.Neurosurg，1998，89(6):991-996.

［8］李现亮，崔才三.自发性脑出血后脑水肿形成机制的研究进展［J］.山东医药，2006，46(10):74-75.

［9］XiG，Keep RF，Hoff JT.Mechanismsof brain injury after intracerebral hemorrhage［J］.Lencet Neurol，2006，5(1):53-63.

［10］Matsuoka H，Hamada R.Role of thrombin in CNSdamage associated with intracerebral haemorrhage opportunity for pharmacological intervention［J］.CNSDrugs，2002，16(8):509-516.

［11］Masada T，Hua Y，XiG，etal.Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist reduces brain edema induced by intracerebral hemorraghe and thrombin［J］.Acta Neurochir Suppl，2003，86 (Suppl):463-467.

［12］李鑫，季楠，赵元立，等.自发性脑出血后继发脑水肿严重程度的影响因素［J］.山东医药，2008，48(28):13-15.

［13］Guo H，Liu D，Gelbard H，etal.Activated protein C preventsneuronal apoptosis via protease activated receptors land 3［J］.Neuron，2004，41(4):563.

［14］代大伟，王德生，蔡军，等.鼠脑内注射凝血酶后水通道蛋白4的表达变化［J］.中国临床康复，2006，10(30):87.

［15］江汉秋，刘群，刘瑾，等.凝血酶对大鼠脑内MMP-9、MMP-2表达的影响［J］.中风与神经疾病杂志，2006，23(1):76.

［16］Jerius H，Beall A，Woodrum D，et al.Thrombin-induced vasospasm:cellular signaling mecchanisms［J］.Surgery，1998，123 (1):46-50.

［17］Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 induction after experimental intracerebral hemorrhage［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22(1):55-61.

［18］Ribo M，Montaner J，Molina CA，al.Admission fibrinolytic profile isassociated with symptomatic hemorrhagic transformation in stroke patients treated with tissue plasminogen activator［J］.Stroke，2004，35(9):2123-2127.