液相芯片技术及其在传染病检测的应用

苏红艳张馨颖李 博陈 曼王习文夏志平

（1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.军事兽医研究所，吉林长春 130118；3.军事兽医、研究所，吉林长春 130118）

液相芯片技术及其在传染病检测的应用

苏红艳1张馨颖1李 博2陈 曼2王习文2夏志平*

（1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.军事兽医研究所，吉林长春 130118；3.军事兽医、研究所，吉林长春 130118）

液相芯片技术，又称流式荧光技术、悬浮式点阵技术或微球依赖的悬浮点阵技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪，它实现了多种技术的有机整合，如计算机运算、编码微球、应用流体学、激光技术及高速数字信号处理，其主要特点在于灵敏度和检测特异性较高。该技术在抗原抗体检测、核酸研究、受体和配体识别分析、酶学分析及免疫分析等研究中得到了广泛应用。

1 液相芯片技术的原理

Luminex xMAP 系统所使用的5.6μm 聚苯乙烯微球具有大小均一的特点，按照严格的比例在每个微球的制作过程中精确掺入了荧光染料，并且为两种不同的红色分类，每种染料的浓度有10种，按照这两种红色分类荧光的不同比例，可以分为100种微球，确保了一个光谱地址对应一个微球。每个微球表面能够进行不同的反应，从而能够同时在一个反应管里进行，并且其不同反应能够检测出100种。在报告分子上第3种荧光素偶联能够定量发生在微球表面的反应。通过 Luminex100TM分析仪的两束激光快速液流传送微球排成单列。当红色二极管激光（635 nm/10mW）能够对微球中的分类荧光染料产生不同程度的影响时，此时便可以确定被测物的定性；如果钇铝石榴石激光（532nm/13mW）能够有效激发微球表面上的报告荧光素，此时便可以确定被测物的定量。最后将上述实验组采集的数据经计算机处理分析后可直接生成判断结果。

2 液相蛋白芯片技术在传染病检测中的应用

“三明治夹心”免疫测定法是液相蛋白芯片的基本原理，与酶联免疫测定法相类似。在待检物的抗体的情况下，则比较简单，这主要由于抗体具有Fc段和Fab段，针对Fab段，在微球上可与它的抗原共价结合，而针对Fc段，报告分子为荧光素所标记的二抗即可。在待检物为抗原的情况下，则要求该抗原的抗原表位至少要有两个，在微球上先与待检物的一种抗体实现共价结合，针对待检物再加入标记有荧光素的另一抗原表位的抗体，以此实现双抗夹心反应。

2.1 病毒性传染病病原体的检测

目前，在传染性疾病诊断领域研究方面，国内外已有许多的研究报道。对于传染病检测的反应原理，液相蛋白芯片技术类似于ELISA法。在建立反应体系中可以自行制备探针交联微球，分析时也可以使用种类繁多的商品化试剂盒，有利于促进科研工作的发展。吴亚玲等建立的液相芯片法利用双抗体夹心法原理检测人血清中的乙型肝炎病毒表面抗原.

因HBsAg可以分为不同的亚型，其主要是根据血清学特性进分类，所以在实验中进行包被时我们主要采用的单克隆抗体有4种，有利于反应不同亚型，从而能有效提高检测的敏感性。但实际上对于阳性标本经过每一种单克隆抗体都无法检测出，由于单克隆抗体的来源不同而检测出的阳性率具有一定差异性，但相互之间能够实现互补。

2.2 病毒性传染病抗体的检测

Steve等建立并评估了牛疱疹病毒1，牛副流感3、牛病毒性腹泻）和牛呼吸道合胞体病毒的抗体的液相芯片多重分析联合检测。姚丽等建立一种高效的人乳头状瘤细胞病毒血清学检测方法，重组质粒表达HPV16/18E6和E7蛋白，同微球偶联后作为抗原，应用Luminex系统检测宫颈癌患者血清中的相应抗体。杨永莉等分别建立鼠疫耶尔森菌、结核分支杆菌、流感病毒、SARS病毒及禽流感病毒等发热病原抗体的液相蛋白芯片定量检测方法，比较液相蛋白芯片方法与生物素-亲和素系统方法的检测能力。

3 液相基因芯片在传染病检测中的应用

核酸分子杂交为液相基因芯片的基本原理，首先氨基化修饰核酸探针，微球表面的羧基与探针分子修饰后的氨基能实现共价结合，从而在微球表面实现交联，在待检核酸通过荧光标记和PCR扩增后，能够与微球上的探针实现杂交反应。在设计扩增引物时，扩增长度应控制在100～300bp之间，从而在微球上能够减少因杂交反应而产生的位阻效应，这样对杂交反应更有利。有相关学者杂交时采用400～1200bp的扩增片断，取得了较好的效果。这表明目的片段的二级结构和基因序列决定着杂交效率。为了进一步提高检测效率，可使液相基因芯片结合多重PCR技术，能够实现同时在一个反应管中进行多项核酸检测。

张万菊等在198份临床标本经VIDRL多重 PCR 方法和多指标同步分析液态芯片技术-呼吸道病毒检测试剂盒方法对甲型流感病毒、乙型流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒、细小 RNA 病毒、副流感病毒、人偏肺病毒（hMPV）检测，总阳性率和符合率分别为：38.89%、45.45%和72.22%。xRVP 方法除能检测上述常见呼吸道病原体外，还能同时将部分病原体进行分型，例如：Flu A 可检测 H1、H3 和 H5 型，呼吸道合胞病毒可分出A和B型，副流感病毒可分出4个型别，冠状病毒可检测出冠状病毒 NL63、229E、OC43、HKU1和 SARS-CoV。郭喜玲等运用液相芯片技术对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒的H5、N1基因同时进行检测，病毒核酸的最低检出量为1pg，检测特异性高。詹爱军等建立可检测新城疫病毒的液相芯片快速检测技术。崔仑标等在研究中利用液相芯片技术，对于肠道病毒通用的V P1、EV71和CAV16的基因、5’UTR基因的液相芯片制备都能够识别。该芯片检测方法不但能够对CA V16、EV71与其它类型的肠道病毒感染进行准确区分，还可以对存在的肠道病毒进行检测。党倩丽等的研究是在LuminexTM100技术平台上开发对人乳头瘤病毒基因分型的检测和定量分析。胡瑞等根据数据库中的小肠结肠炎那尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气芙膜梭菌、鼠疫邓尔森氏菌基因序列建立了液相基因芯片联合检测技术。