LY294002抑制成骨肉瘤细胞U2－OS侵袭迁徙

毛建华 罗庆丰 刘志礼 王 恒 朱粮博 龙新华 周荣平

PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞增殖凋亡及药物耐受中起着非常重要的作用［1-2］，但是其化学抑制剂LY294002对成骨骨肉瘤细胞迁徙侵袭的影响尚未见报道，本研究以成骨肉瘤细胞系U2-OS细胞为研究对象，给予 LY294002干预，MTT，wound healing和 Transwell invasion实验检测细胞增殖、迁徙和侵袭能力，探讨LY294002对成骨肉瘤细胞侵袭迁徙的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

骨肉瘤细胞株U2-OS购自中国医学科学院肿瘤研究所，并由南昌大学第一附属医院医学中心冻存。F12型培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程有限公司;PBS购自北京百灵威化学试剂有限公司;胰蛋白酶冻干粉(含EDTA)购自美国Sigma公司;DMSO、MTT购自美国Sigma公司，Transwell趋化板购于 Costar公司(8.0 μm Pore Size)。LY294002购于Sigma。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞贴壁生长于含10%FBS的F12型培养液中，其中青霉素100 U/ml、链霉素 100 mg/ml，于 37℃、5%CO2的饱和湿度孵育箱中培养。待细胞长至约80%满后，弃去旧培养基，以适量胰酶(0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA=1∶1)消化细胞，弃去消化液并加入适量培养基洗涤，再以适量培养基反复轻轻吹打后制备细胞悬液，计数，以1∶4的比例传代培养。

1.2.2 细胞增殖实验 取对数生长期细胞进行实验，调整细胞数为4×105/L，接种于无菌96孔培养板，每孔200 μl，于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养12 h。按加入药物的不同分为2组。实验组分别给予5、10、20、40、80、160 μM 的 LY294002(5 mg LY294002粉末溶于1 ml的DMSO中配成10 μM的母液，再取母液用培养基稀释配成实验组浓度);对照组给予DMSO(DMSO的浓度为0.1%)。每组的每个浓度下设6个复孔，培养24 h后，每孔加入20 μl的噻唑蓝(MTT 5 g/L)。孵育4 h后，吸弃各孔培养液，每孔加入DMSO 150 μl。微振荡10 min后，于酶标仪波长490 nm处测吸光度(A)值。以上各组实验重复6次。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组A值/对照组A值)×100% 。

1.2.3 流式细胞术检测LY294002对U2-OS细胞凋亡的影响 取对数生长期细胞进行实验，调整细胞浓度为1×106/ml，接种于直径为6 cm的培养皿中，每皿250 μl，于 37 ℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养 12 h。按加入药物的不同分为2组。实验组分别给予20、40、80 μM 的 LY294002(5 mg LY294002 粉末溶于 1 ml的DMSO中配成10 μM的母液，再取母液用培养基稀释配成实验组浓度);对照组给予DMSO(DMSO的浓度为 0.1%)。培养 24 h后，每孔加入 1 ml 0.25 g/L胰酶(不含 EDTA)，消化重悬，PBS洗涤2次后(1 500 转/分离心 3 min)500 μl Binding Buffer重悬，并加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl Propidium Iodide混匀，室温、避光反应 5～15 min，应用FAcs calibur流式细胞仪检测(BD，USA)。以上各组实验结果重复6次。

1.2.4 Wound healing迁徙实验 对数生长期处于细胞传代后第3～5天，取对数生长期细胞进行实验;用胰酶消化细胞，含10 g/L BSA的无血清DMEM-F12培养液重悬，调整细胞数5×105/ml，接种于6孔细胞培养板，给予不同浓度(0、40 μmol/L)的 LY294002作用细胞24 h后，用200 μl枪头单层细胞表面在孔中划一直线垂直于记号线。用PBS漂洗2次以去除划下的悬浮细胞;加入无血清DMEM-F12培养液(内含1%BSA)继续培养24 h，倒置显微镜下观察划痕中细胞迁徙情况并照相;Image J分析软件进行迁徙距离测量，计算各组细胞迁徙率;不同时间重复实验6次。

1.2.5 Transwell侵袭实验 将冻存于 －80℃ 冰箱的BD matrigel基质胶4℃静置24 h，使之转为液态。常规细胞培养后，终止培养，吸除血清让细胞饥饿12～24 h。按 1∶7 比例稀释 Matrigel，取 20 μl的 Matrigel，加入140 μl的F12型无血清培养液，充分稀释混匀(冰浴操作)。在Transwell小室的多聚碳酸滤膜上预铺 Matrigel基质胶(约 60 μl/孔)，每孔加入 50 μl含10 g/L BSA(牛血清白蛋白)的无血清培养液，37℃放置3 h，室温过夜干燥。常规消化离心细胞后，用配备好的10 g/L BSA(牛血清白蛋白)重悬，调整细胞密度至1×105个/ml。在Transwell小室的上室中，分别加入150 μl已用40μM LY294002处理的细胞悬液和用正常培养基培养的细胞悬液，每孔下室加入500 μl含血清的培养基。将小室置于37℃ 、5%CO2孵育箱中24 h后用棉签轻轻地刮除小室内微孔膜边缘的细胞，甲醇固定15 min，再用4 g/L的结晶紫染色30 min后取出Transwell小室，PBS淋洗2遍，再倒置显微镜下观察细胞穿膜情况并拍照，Image J分析软件计数。进行不同时间重复实验6次。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0处理系统进行统计学分析，实验数据以均数±标准差(s)表示，采用Independent Samples T Test分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002抑制U2-OS细胞增殖

不同浓度LY294002作用U2-OS细胞24 h，能有效抑制U2-OS细胞增殖并呈剂量依赖性，IC50为47.96 μM，所以确定进一步的迁徙和侵袭实验中采用LY294002的浓度为40 μM。

2.2 LY294002诱导U2-OS细胞凋亡

不同浓度LY294002作用U2-OS细胞24 h凋亡率随着浓度的增高而提高，这提示LY294002能诱导U2-OS细胞凋亡并呈剂量依赖性。

2.3 LY294002对U2-OS体外迁徙的影响

wound healing分析结果显示，经40 μM LY294002作用24 h组平均细胞迁徙率为(37.97±2.49)%，未经LY294002作用细胞组迁徙率为(83.78±2.84)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 LY294002对U2-OS体外侵袭的影响

40 μM LY294002处理细胞24 h穿膜细胞数平均为(36.1 ±5.0)个/视野，未经 LY294002 作用细胞平均穿膜细胞数为(89.1±6.4)个/视野，两者差异有统计学院意义(P ＜0.01)。

3 讨论

骨肉瘤是1种高度恶性的骨肿瘤，其发病率在儿童及青少年的原发骨肿瘤中占据首位。虽然随着新辅助化疗药物使用骨肉瘤患者5年生存率有了大幅度的提高［3-5］，但是近30年来无明显进一步的提高，主要原因是早期发生肺部转移和获得性耐药［3，6］。新的抗骨肉瘤策略是亟待解决的热点。由于PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生、发展中的重要作用，因此研究PI3K/Akt信号通路对于探索新的肿瘤治疗方法具有重要价值。

LY294002是1种广泛应用的PI3K/AKT信号通路抑制剂，可特异性 抑制PI3Kp110亚单位的催化活性，但因其对细胞具有一定毒性作用，目前还限于体外研究，尚未发展到临床应用。郭花等［7］研究发现LY294002除了能特异性抑制PI3K和p-Akt表达外，对HIF-1mRNA表达也有一定抑制作用。大量文献报道，LY294002能有效的诱导肿瘤细胞凋亡而抑制增殖［8-9］。本研究发现，LY294002能显著的抑制U2-OS细胞增殖，并且呈剂量依赖;40 μM的LY94002作用细胞24 h后细胞凋亡率显著的高于未经LY294002处理细胞，这提示LY294002能通过诱导U2-OS细胞凋亡而抑制其增殖。最近有研究［10-12］发现LY294002能抑制肿瘤细胞侵袭转移。本研究中，我们采用40 μM的LY94002作用U2-OS细胞24 h后通过wound healing和Transwell invasion检测细胞迁徙、侵袭能力，结果显示经LY94002处理的细胞组细胞迁徙率和穿膜细胞数显著的低于未经 LY94002作用组，这提示LY94002能抑制U2-OS细胞体外迁徙侵袭。

总之，我们结果提示，LY94002能通过诱导U2-OS细胞凋亡而抑制其增殖，并且能抑制其迁徙侵袭，有望成为抗骨肉瘤治疗的药物。但是，由于体内微环境对肿瘤增殖、侵袭转移起着非常重要的作用，所以，还需大量的实验来证实其能否具有抗骨肉瘤作用;另外，其生物安全性也还有待于进一步探讨。

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