免疫胶体金技术的应用与展望

陈俊彦，肖琼

免疫胶体金技术的应用与展望

陈俊彦，肖琼

(南京信息工程大学滨江学院，南京 210044)

免疫胶体金技术是一种新型固相标记免疫检测技术，因其独特的性质在许多领域得到广泛应用和快速发展。简述了免疫胶体金技术在电镜、光镜快速检测诊断中的发展以及在生物医学、免疫组织化学和细胞生物学等领域的研究和应用。未来免疫胶体金技术在提高胶体金制备质量的同时将实现定量和多元化检测。

免疫胶体金技术；快速诊断；生物医学；应用

免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique，ICG)是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应进行的固相标记免疫检测技术。继荧光素、放射性同位素和酶检测技术之后，免疫胶体金技术已广泛应用于生物医学、免疫组织化学和细胞生物学等研究领域。

1971年Faulk等［1］首次将胶体金与抗体结合应用于免疫电镜，研究沙门菌壁细菌表面抗原的分布。1977年Geoghegan等［2］应用免疫胶体金染色技术(immuno-gold staining，IGS)，在光镜水平检测B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白。1983年Holgatet等［3］在胶体金染色的基础上，增加了银显影技术，免疫金银染色技术(immuno-gold silver staining，IGSS)取代了传统的荧光素和酶等物质。随着研究的不断深入，以肉眼观察水平的免疫胶体金快速诊断技术在快速检测中得到了广泛的应用和发展［4］。

1 免疫胶体金技术的基本原理

胶体金是氯金酸(chloroaurie acid，HAuCl4)在还原剂(白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等)作用下，聚合成带负电的疏水胶溶液。胶体以金颗粒为核，表面吸附AuCl4-和H+双层离子，与蛋白质分子及其它非共价的生物大分子(毒素、酶、抗生素、激素、多肽等)正电荷基团形成静电结合，且不影响其生物特性［5］。胶体金标记技术实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程［6］。

利用还原法从氯金酸溶液中可制备直径1～150 nm大小不同的胶体金颗粒。溶胶的颜色与粒径大小相对应：5～20 nm溶胶呈葡萄酒红色；20～40 nm液体为深红色；60 nm以上金溶液呈紫红色［7］。在适宜条件下，抗原和抗体与胶体金颗粒反应产生聚集，达到一定的密度时，大量聚集的标记物显示出肉眼可见的红色或粉红色斑点。因此免疫胶体金技术在基础研究和检验检疫中定性或半定量的快速检测中得到广泛的应用［8］。

2 免疫胶体金在电镜水平的应用

免疫胶体金电镜技术是在分子水平上对细胞抗原进行形态学研究较为理想的方法［9］，其最大优点是通过不同大小金颗粒或结合酶标进行双标记或多标记，在同一标本上显示两种不同抗原，有助于细胞内生物活性物质的定位，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位，了解细胞组织中的相互关系及代谢过程［10-11］。Jia等［12］应用免疫胶体金电镜技术对蚕豆叶片细胞研究，发现蚕豆幼嫩叶片和成熟叶片叶肉细胞中金颗粒分布的不同。陈以峰［13］等研究发现烟草受精前后卵细胞内吲哚乙酸(IAA)的分布变化。

胶体金颗粒具有很高的致密性，有利于超微结构的观察，病毒颗粒的检出数比直接电镜法高100～300倍，是免疫电镜的最佳标记物［14］。免疫胶体金颗粒应用于病毒抗原的检测显示出无可比拟的优越性，已成为病毒形态学和抗原特性研究的有效手段。谢希贤等［15］研究对虾白斑综合症病毒蛋白VP24，发现核衣壳未见标记金颗粒，完整病毒粒子上标记的金颗粒很少，在囊膜部分被损的病毒粒子上可观察到大量的金颗粒，由此认为病毒蛋白VP24可能存在于囊膜和核衣壳之间。吴正理等［16］在被感染微孢子虫的家蚕丝腺组织中发现寄生位点宿主组织内存在大量金颗粒，说明寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质，证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。

3 免疫胶体金在光镜水平的应用

应用胶体金颗粒呈桔红色到紫红色的特性，在光镜水平检查细胞表面抗原，具有操作步骤少、制片稳定、染色易控制，呈色鲜明的优点。免疫胶体金取代了荧光素和酶等标记物，弥补了因标记物引起的本底过高和内部酶活性干扰。为提高胶体金标记在光镜检测中的灵敏度，在胶体金染色的基础上增加了银显影，使金属银在金表面聚集，聚集的银在催化作用下，更多的银被还原，胶体金标记的结合位点将被更好地观察［17-18］。孙修勤等［19］采用IGSS技术，对中国对虾胰脏上皮细胞内的细小病毒(hepatopancreatic parvovirus，HPV)包涵体进行了免疫组织化学的诊断研究，结果证明，IGSS是可应用于中国对虾肝胰脏细小病毒病诊断的有效方法。张铁汉等［20］采用IGSS检测抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，克服了间接免疫荧光法(indirect immunof l uorescence，IIF)易衰减的问题，用普通光镜镜检，实验结果易于保存，便于基层医疗单位推广。

IGSS染色法是光镜条件下植物组织内抗原定位的理想方法，克服了免疫酶法因植物体内内酶及某些物质对反应产生干扰而出现反应产物扩散现象，导致定位效果不理想的缺点。免疫荧光法因植物组织内有自发荧光干扰，特别是在抗原量低时，自发荧光强于特异性荧光，致使观察困难。冯家望［21］应用IGSS染色法对水稻稻种细菌性条斑病进行了组织免疫定位，取得了良好的结果。

在病理学诊断中，IGSS染色法具有高敏感性和高特异性，可以准确地对病变组织进行定位和定性。张铁汉等［22］应用IGSS染色法，建立了光镜水平检测血清抗核抗体，使基层医院自身免疫性疾病的诊断得到开展，将IGSS染色法的应用从形态学诊断提高到免疫学水平。

4 免疫胶体金快速诊断技术的应用

免疫胶体金快速诊断技术是建立在酶联免疫吸附试验、乳胶凝聚试验、单克隆抗体技术和免疫金标记技术基础上，以胶体金为标记物，通过肉眼直接观察判断结果。该法具有操作简单快速，特异性强，检出限低，结果判断直观、准确和无污染的优点。在临床医学检测、动植物检疫、食品安全检测、药物残留的快速检测以及抗原抗体检测等领域发展迅速。目前应用最为广泛的是斑点免疫金渗滤法(dot immunogold fi ltration assay，DIGFA)和胶体金免疫层析法(golloidal gold immunochromatographic assay，GIGA)。

4.1 斑点免疫金渗滤法

DIGFA采用胶体金为标记物，以硝酸纤维素膜(NC膜)为固相载体，将试剂和样本滴加在膜上，通过渗滤使抗原抗反应，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体，阳性结果在膜上呈红色斑点。

大肠埃希菌(enterohemorrhagic eschetichia coli)是引起人类食物中毒的肠道致病菌。谌志强等［23］应用大肠埃希菌O157：H7多克隆抗体包被胶体金制备探针，大肠埃希菌O157：H7菌悬液的检测下限达到3.1×106CFU／mL，具有很强的特异性，适用于现场检测。

旋毛虫病(trichinosis)是由旋毛虫寄生于动物体内引起的一种较常见的人兽共患寄生虫病。候小君等［24］建立Ts21重组蛋白——斑点免疫金渗滤法(Ts21-dot immunogoldfi ltration assay，Ts21-DIGFA)，检测结果显示，Ts21-DIGFA对人类旋毛虫感染者血清抗体的敏感性为94.73%，特异性为86.96%；猪血清抗体的敏感性88.89%，特异性100%。小鼠感染旋毛虫4～6周后，血清抗体的检出率均为100%。整个操作过程仅需3 min，适用于人和动物旋毛虫病的快速血清学诊断及流行病学调查。

赤羽病(akabane disease，AKAD)又称阿卡斑病，是由阿卡斑病毒(akabane virus，AKAV)引起家畜感染的病毒性传染病，是我国动物疾病防控和国际动物贸易中重点检疫的7种疫病之一。张吉红等［25］应用DIGFA检测赤羽病抗体，提纯AKAV抗原的最佳点样质量浓度为0.099 mg／mL，包被NCM膜，5 min判定结果，具有较好的特异性、重复性和稳定性，该法有利于基层动物防疫工作中AKAV病毒的发现和诊断。

4.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析(GICA)法是将胶体金标记技术、层析分析技术和免疫检测技术等多种方法结合，具有结果清晰，无污染，携带方便等优点的快速免疫分析方法［26］。在免疫渗滤法的基础上，Beggs等［27］建立了检测人尿和血清中绒毛膜促性腺激素(HCG)的GICA法。从此GICA检测技术在临床检测、毒品检测、微生物检测、农兽药残留和食品检测等方面得到广泛应用［28］。

炭疽芽孢杆菌(bacillus anthraris)是牧区食草动物常见炭疽病的病原菌，也是人兽共患疾病的病原菌之一，在军事上被列为头号生物战剂。李伟等［29］利用GICA技术，采用双抗夹心法，15～20 min可观察结果，敏感性为1×106CFU／mL，反应体系中芽孢最低检测出8×l04个，滋养体细胞检测敏感性为1×107CFU／mL，与同属菌株特异性评价结果均为阴性。该法具有样品处理方法简便，操作灵活，结果判断直观，适用于现场快速检测的特点，尤其是对生物恐怖袭击的含炭疽芽孢的白色粉末检测。

腹泻性贝毒(diarrhetic shellf i sh poisoning，DSP)是一类分布较广的赤潮毒素，严重威协着人类的健康和安全。刘仁沿等［30］利用胶体金标记细胞融合技术，建立GIGA法快速检测腹泻性贝毒软海绵酸，检出限为12 ng／mL，时间为15 min，不受其它因素干扰，完全满足规定阈值。

磺胺类药物(sulfonamides，SAs)在中国、欧盟和美国均为动物饲养过程中限制使用的药物，动物源性食品中的最高残留限量(MRL)为0.1 mg／kg。韩静等［31］采用GICA检测动物源食品中磺胺异口恶唑(SIZ)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺对甲氧嘧啶(SME)、磺胺甲二唑(SMT)、磺胺氯哒嗪(SCPA) 5种磺胺类药物残留。以肉眼观察检测线颜色变化判断结果，视觉检测限为0.01 mg／kg，检测时间为10 min，具有较高的灵敏度和特异性，操作快速简单，结果稳定可靠，可作为现场监控的有效筛检手段。

食品中常见的致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等，食源性致病菌和毒素的快速检测是食品安全监管的有效手段。高成秀等［32］建立大肠杆菌O157和志贺毒素(shiga toxin，Stx2)的双抗夹心胶体金免疫层析法，大肠杆菌O157敏感性为1×105CFU／mL，特异性为87.5%；Stx2检测下限为200 μL细胞培养液，特异性为50.0%。王中民等［33］采用GIGA法建立了沙门菌的快速检测，灵敏度达2.1×106CFU／mL，检测结果无差异。

葡萄球菌C型肠毒素(staphyloccucal enterotoxin C，SEC)是金黄色葡萄球菌(staphyloccucal aureus)蛋白质外毒素的常见血清型毒素。杨丽君等［34］研制了GICA检测试纸用于葡萄球菌C型肠毒素的检测，灵敏度达10.0 ng／mL，在5～10 min内完成检测，肉眼判断结果，该法是现场检测的最佳方法。

5 免疫胶体金技术的展望

5.1 提高胶体金的制备质量

免疫胶体金技术是以胶体金颗粒为标记物，因此制备大小均匀、分散度好的胶体金颗粒在检测中至关重要。金颗粒的形状不规则或颗粒不均匀，使胶体金标记物容易解离和沉淀，导致金标记物扩散不完全和假阳性；金颗粒直径的变异范围太大也会影响试验的稳定性和重复性。因此除了确保试剂质量，胶体金制备过程中的每个细节都很重要，如认真做好操作环境和容器的清洁；根据试验目的选择胶体金的粒径，依据粒径确定还原剂；改善胶体金制备工艺，以获得尺寸合适、形状均匀的胶体金。

5.2 提高检测灵敏度，拓宽检测范围

提高检测灵敏度的关键是对捕获信号进行放大。大多数检测样品的检测水平可以达到1.0 ng／mL或更小的量，而许多待分析物对金标记无法达到肉眼视觉的敏感性。利用银增强金标记强度，可获得增加100倍的检测敏感性。小量的银沉降量适用于电镜观察，大量的沉降量可以直接用肉眼观察。

金和银自身不产生荧光，在金染色和金银染色的基础上，联合使用荧光标记，可以使彩色影象鲜明，有效增强信号的响应。采用新的标记物或引入生物亲和素系统(BSA)等措施，同时结合相应的生物传感器和电化学设备等，对靶信号染色标记，可拓宽检测范围［35-37］。实现多重标记，对组织化学和免疫化学进行研究将是强有力的技术方法。

5.3 实现半定量或定量检测

快速检测以定性为主，主要检测样品中是否存在某种特定成分，结果仅显示阳性或阴性。随着检测要求的不断提高，很多检测需要确定特定分析物含量。免疫胶体金快速诊断技术，通过检测线结合已知定量的分析物，产生温度计式的条带梯度，达到定量或半定量的检测目的［38］。视觉上将测试结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性，以提供定量或半定量的检测结果。

5.4 实现多元化检测

多元化检测是指一次检测可同时得到多个结果，对于联合检测具有较高应用价值。采用多膜复合或单膜多元受体固定的方式，是实现多元检测的有效方法。Buechler等［36］研制了在同一膜上包被多元抗体，可同时检测7种药物的免疫层析试纸条。

6 结语

免疫胶体金技术具有单份检测、简单快速、特异性强、灵敏度高，无需辅助试剂和特殊仪器，以及肉眼观察结果，实验结果可长期保存等优点，是其它免疫学方法无可比似的。随着该技术应用范围的扩展，进一步提高检测灵敏度和可重复性，实现半定量、定量和多元检测是免疫胶体金技术未来的发展方向。

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Application and Prospect of Immune Colloidal Gold Technique

Chen Junyan，Xiao Qiong
(Nanjing University of Information Science & Technology, Bin Jiang Institute，Nanjing 210044，China)

Immune colloidal gold technique is a new kind of solid phase marked immune detection technology，it is widely applied in many fi elds and developed rapidly owe to its unique characteristics. The research and application of the immune colloidal gold technique in the rapid diagnosis with electron microscope，light microscope，and the fi eld of biomedical，immunohistochemical and cell biology were brief l y discussed. In the future，the technique of immune colloidal gold will improve the quality of colloid gold and achieve quantitative and diversity detection at the same time.

immune colloidal gold technique; rapid diagnosis; biomedical; application

O657

A

1008-6145(2014)01-0101-04

联系人：肖琼；E-mail: jc3293@humboldt.edu

2013-11-12

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.01.030