对乙酰氨基酚诱导小鼠药物性肝损伤中PCNA的表达

赵 琼，符晓楠，李三强

·基础医学·

对乙酰氨基酚诱导小鼠药物性肝损伤中PCNA的表达

赵 琼1，符晓楠2，李三强3

目的研究对乙酰氨基酚(Acetaminophen,AAP)诱导的小鼠药物性肝损伤过程中增殖细胞核抗原(PCNA)表达的动态变化，进一步阐明PCNA在药物性肝损伤中的重要作用。方法利用AAP溶液(550 mg/kg)腹腔注射诱导小鼠药物性肝损伤。取正常对照小鼠和注射AAP后6、24、48、72 h的小鼠肝脏制备匀浆液，利用蛋白印迹的方法检测小鼠肝损伤过程中PCNA的表达变化；同时检测各时间点小鼠血清中AST和ALT酶活变化。结果小鼠注射对乙酰氨基酚后，血清中AST和ALT酶活逐渐升高，24 h达到高峰后逐渐降低，72 h恢复到接近正常水平。PCNA在注射对乙酰氨基酚后6 h，其表达量显著下降，在24 h表达量达到最低值，随着损伤后的修复，PCNA的表达量逐渐增高，72 h逐渐恢复接近正常水平。结论PCNA在AAP诱导的小鼠药物性肝损伤过程中表达出现显著变化，AAP诱导的药物性肝损伤过程存在一个损伤与修复逐渐变化的过程。

PCNA；对乙酰氨基酚；药物性肝损伤

乙酰氨基酚(AAP)在大剂量使用时，可引起人和动物严重的药物性肝脏损伤，学界已有一些对其相关机制的研究，但关于AAP引起药物性肝损伤过程中具体的分子机制还未有深入的研究。PCNA(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)又称增殖细胞核抗原，是反应细胞增殖状况的一个重要的指标，常被用作分析肝脏损伤与修复的情况[1]。本研究重点分析PCNA在AAP诱导的小鼠药物性肝损伤过程中的表达情况，为进一步研究因AAP诱发的药物性肝损伤的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料河南科技大学医学院实验动物中心提供昆明种SPF小鼠，体质量(22±2) g；AAP购自广州白云山制药厂；PCNA鼠源性单抗由北京中杉公司从Santa Cruz公司代购；HRP标记羊抗小鼠二抗购自北京中杉公司；中生北控公司提供AST和ALT酶活检测试剂盒；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 AAP诱导小鼠药物性肝损伤动物模型 利用AAP溶液(550 mg/kg)腹腔注射小鼠诱导小鼠药物性肝损伤(n=24)。取正常对照小鼠(n=6)和注射AAP后6、24、48、72 h的小鼠肝脏制备匀浆液，每个时间点6只小鼠，利用蛋白印迹的方法检测小鼠肝损伤过程中PCNA的表达变化。同时检测正常和注射AAP后各时间点小鼠血清中AST和ALT酶活变化。

1.2.2 AST和ALT酶活性检测 小鼠血清AST和ALT酶活情况参照试剂盒说明书进行测定。

1.2.3 蛋白印迹法检测小鼠肝损伤过程中PCNA的表达情况 利用Bradford方法对蛋白进行定量，取70 μg蛋白进行电泳和转膜，而后利用脱脂奶粉(5%)进行封闭，利用PBS/Tween20洗膜后加入PCNA一抗(1∶800)，37℃孵育1 h后再利用PBS/Tween20洗膜后加入HRP标记的二抗(1∶800)，37℃孵育1 h后加入DAB进行显色。

2 结果

2.1 AST和ALT酶活性检测结果AAP注射小鼠后，随着药物作用时间的延长，血清中AST和ALT酶活性显著增高，在24 h达到最大值，然后逐渐降低，72 h恢复到接近正常水平，验证小鼠AAP诱导药物性肝损伤模型成功。

2.2 蛋白印迹检测结果在小鼠注射对乙酰氨基酚后PCNA表达的相对积分光密度值0 h(3.1±0.42)，6 h(2.4±0.32)，24 h(1.3±0.23)，48 h(2.5±0.39)，72 h(3±0.44)。PCNA在注射对乙酰氨基酚后6 h，其表达量显著下降，在24 h表达量达到最低值，随着损伤后的修复，PCNA的表达量逐渐增高，72 h逐渐恢复接近正常水平，蛋白印迹结果经Gel Pro4.0软件分析蛋白条带后得出的积分光度值，Beta-actin作为内参。

3 讨论

本文研究了AAP诱导的小鼠药物性肝损伤过程中PCNA的表达变化，初步阐明了PCNA在药物性肝损伤过程中的重要作用。

由于PCNA主要在细胞周期的S期合成，与细胞增殖密切相关。因此，PCNA常被用作检测细胞增殖的一个重要的指标[2-5]。通过检测AAP诱导的小鼠药物性肝损伤过程中PCNA的表达情况来反映肝脏损伤与修复的情况。PCNA在AAP诱导的小鼠药物性肝损伤过程中表达呈显著变化趋势，PCNA在小鼠注射对乙酰氨基酚后6 h，其表达量显著下降，在24 h表达量达到最低值，说明注射AAP后0～24 h时间段，AAP可能通过抑制细胞增殖而造成肝脏的损害；而后PCNA的表达量逐渐增高，72 h逐渐恢复接近正常水平，说明随着肝脏损伤后的修复，PCNA表达量增高，肝细胞通过增殖来补偿修复损伤的肝组织。

总之，本文初步研究了PCNA在AAP诱导的药物性肝损伤过程中的表达情况，为进一步研究AAP诱导的药物性肝损伤的分子机制奠定基础。

[1]Celis JE,Madsen P,Celis A,et a1.Cyclin (PCNA,auxiliary protein of DNA polymerase delta) is a central component of the pathway(s) leading to DNA replication and cell division[J].FEBS Lett,1987,220 (1): 1-7.

[2]Kelman Z.PCNA:structure,functions and interactions[J].Oncogene,1997,14 (6): 629-640.

[3]Morrow PW,Tung HY,Hemmings HC Jr.Rapamycin causes activation of protein phosphatase-2A1 and nuclear translocation of PCNA in CD4+ T cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,323 (2):645-651.

[4]Assy N,Gong Y,Zhang M,et a1.Use of proliferating cell nuclear antigen as a marker of liver regeneration after partial hepatectomy in rats[J].J Lab Clin Med,1998,131 (3): 251-256.

[5]Xu CS,Lu AL,Xiong L,et a1.Changes of ACP,AKP,HSC70/HSP68 and PCNA in growth and development of rat liver[J].Dev Reprod Biol,2000,9(2):1-14.

ExpressionAnalysisofPCNADuringDrug-inducedLiverInjuryInducedbyAcetaminopheninMice

ZHAO Qiong,FU Xiao-nan,LI San-qiang

(First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the dynamic changes of PCNA during drug-induced liver injury induced by acetaminophen in mice and further clarify the important roles of PCNA in the drug-induced liver injury.Methods24 healthy male mice were injected intraperitoneally acetaminophen solution (diluted with saline,550 mg/kg).Eye blood was respectively collected at 6,24,48,72 h after acetaminophen injection.Serum was separated,and then AST and ALT activity were measured.At the same time,the livers of mice were prepared for 10% liver homogenate.Six mice were used at each time point.At the same time,six normal mice were used as controls.Western blotting was used to detect the expression changes of PCNA during acute liver injury in mice.ResultsAST and ALT activity were gradually increased with time delayed and got to the peak levels at 24 h,then gradually recovered to the normal level at 72 h after acetaminophen injection.The expression of PCNA was significantly decreased at 6 h and got to the lowest level at 24 h.Then the amount of PCNA expression gradually returned to normal level at 72 h after AAP injection.ConclusionThe expression of PCNA is significantly changed during drug-induced liver injury induced by acetaminophen in mice,which indicates that the process of acute liver induced by AAP includes gradual process of injury and repair.

PCNA；acetaminophen；acute liver injury

河南省高校科技创新人才支持计划资助项目(13HASTIT025)

2013-12-15

1.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003 2.洛阳市涧西区妇幼保健中心，河南洛阳 471003 3.河南科技大学医学院，河南洛阳 471003

赵琼(1972-)，女，河南洛阳人，护师，从事肝脏损伤与修复研究工作。

李三强，副教授，E-mail: Sanqiangli2001@163.com

R634

A

1672-688X(2014)01-0001-02