产肠毒素大肠杆菌疫苗在断奶仔猪中的应用

杨佳亮 ，傅胜才 ，杨 青

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

产肠毒素大肠杆菌疫苗在断奶仔猪中的应用

杨佳亮1，2，傅胜才2，杨 青1，※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要病原之一。通过免疫母猪，新生仔猪通常可以从初乳和乳汁得到有效保护，但在断奶阶段，母乳的保护消失。有关研究发现，引起断奶仔猪腹泻常见的ETEC菌株均有菌毛F4或F18。这些菌毛是重要的毒力因子，它们使细菌结合到宿主易感肠上皮细胞，在肠内定植繁殖，随后分泌肠毒素引起腹泻。文章针对由菌毛F4和/或F18产毒素大肠杆菌引起的腹泻，概括了在养猪生产中其相关免疫接种途径，包括口服弱毒苗和亚单位疫苗、胶囊疫苗和注射免疫接种等。

产肠毒素大肠杆菌；菌毛；免疫；断奶仔猪

产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起人、猪和牛肠道感染的的一个主要病原之一。在新生仔猪和断奶仔猪中，ETEC引起的腹泻可导致高的发病率和死亡率，造成巨大的经济损失。菌毛，又称为粘附素，是ETEC表面的一种纤毛样物,通过与宿主小肠上皮细胞特异受体结合,使得细菌在肠黏膜上定植并繁殖产生肠毒素从而导致腹泻[1]。在猪中，五种ETEC菌毛与腹泻有关，分别是：F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F7(F41)和F18。在发生腹泻和死亡的新生仔猪、哺乳期仔猪以及刚断奶的仔猪中，F4菌毛最常见。而F5、F6和F41主要与新生儿腹泻有关，F18菌毛则与断奶仔猪腹泻密切相关。F4菌毛的抗原突变体有F4ab、F4ac和F4ad，其中F4ac是目前最常见的。F18有F18ab和F18ac突变体，其中F18ac与断奶仔猪腹泻密切相关，而F18ab主要与水肿性疾病相关[2]。

ETEC在肠道内定植后生长增殖，随后释放肠毒素引发细胞内水、电解质失衡导致水样腹泻。ETEC分泌的肠毒素包括不耐热肠毒素（LT）、耐热肠毒素 a（STa）、耐热肠毒素 b（STb）和肠聚集热稳定肠毒素1（EAST1）[3]。虽然大多数新生仔猪可以通过免疫后母猪的初乳和乳汁获得保护，但是ETEC感染非侵入性胃肠道感染，因此粘膜免疫比系统免疫更为重要。目前市场上有几种疫苗，包括：带菌毛的灭活菌、带LT的纯化菌毛或不带LT的纯化菌毛菌应用怀孕母猪。但随着母猪年龄的增大，通过这些疫苗所获得免疫逐渐降低；而且在断奶时催乳免疫突然消失，导致刚断奶的仔猪很容易感染肠杆菌。为了保护刚断奶的仔猪，积极的肠道粘膜免疫应答尤为重要。

1 口服亚单位疫苗的应用

在感染时，由于菌毛在细菌定植的过程中扮演着至关重要的角色，使得口服菌毛疫苗的研发发展迅速。纯化的F4ac菌毛是一种很强的口服免疫原，在断奶仔猪中，连续两天口服1mg后，在第4、7、8和11天可分别导致派伊尔淋巴集结、肠系膜淋巴结、血液和固有膜中分泌F4特异性抗体的细胞出现，所诱导产生的IgA应答可与口服感染ETEC产生的应答相比。当断奶仔猪连续3天接种口服疫苗并在初免后第16天加强免疫一次，可以完全能预防口服含F4菌毛的ETEC所致的感染。Joensuu等人建议可用转基因食用苜蓿植物作为F4菌毛粘附和主要亚单位FaeG的载体，这样既安全又廉价，但研究表明效果不是很理想[4]。

与菌毛F4相比，当用F18大肠杆菌感染时，口服纯化的F18不能诱导产生保护性的免疫应答，当F18菌毛剂量达30mg并联合使用粘膜佐剂LT（R139G）也不能产生保护效果[5]。这两种菌毛所产生的免疫原性差异可能它们的结构相关。F18的粘附素是小亚基FedF，然而F4菌毛的粘附素主要菌毛大亚基FaeG。在最近的研究中发现，当断奶仔猪口服重组FedF并联合使用F4菌毛时，能减少粪便中F18阳性大肠杆菌的排泄。这种联合疫苗的研发开启了一种对抗F4和F18感染的新途径[2]。

2 口服活疫苗的应用

口服弱毒苗和野生型无致病大肠杆菌活苗是ETEC疫苗接种的另外一种好的途径。当动物口服这些疫苗后，疫苗菌粘附到小肠细胞触发产生免疫应答，并迅速产生特异性抗原sIgA抗体，阻止产生同类菌毛的致病性菌的繁殖。可Bozic等人报道：在断奶后的第4天，断奶仔猪单次口服表达F4ac的弱毒大肠杆菌后，在第7天不能抵抗强毒力菌株的感染[6]。一种名为Coliprotec的口服活疫苗今年来相继在加拿大、巴西、美国等地开始应用，这种疫苗可抵抗F4阳性ETEC引起的腹泻。这种疫苗含有天然无致病力的大肠杆菌，表达F4粘附素但不产生毒素。临床实验证明Coliprotec能很好的抵抗致病性F4阳性ETEC的感染且安全性好。F4阳性ETEC引起的断奶后腹泻（PDW）一般发生在断奶后3～10天，因此，从断奶第1天至发生有一个时间间隔无法得到保护。为了避免这种情况，第一次接种最好在哺乳期，但在这个阶段胃肠道存在的哺乳期抗体也许会影响疫苗株的繁殖甚至免疫失败。虽然Bertschinger等人在试验中用F18ac阳性大肠杆菌疫苗免疫哺乳仔猪（由带有F18特异性初乳IgA抗体的母猪所产）取得了好的效果，但对F18ab没有起到交叉保护[2]。另外，在Coddens等人的研究中发现，日龄10天的仔猪中不表达或弱表达F18受体，在这些猪肠道中不太可能有细菌的繁殖[7]。因此，对这种疫苗的保护作用需进一步研究。

3 胶囊亚单位活疫苗的应用

为了提高活疫苗和亚单位疫苗的效果，胶囊疫苗的应用起到了较好的作用。在哺乳期间，胶囊疫苗可以保护疫苗在胃肠道运输过程中被母源抗体和其他的乳汁因子（如乳脂球上的受体类似物或乳清等）中和掉。Felder等人检测了微型胶囊疫苗的效果，他们将F18阳性大肠杆菌和F18菌毛装在聚丙交酯-乙交酯(PIgA)微球中，通过喷雾干燥和口服的方法免疫新生仔猪和断奶仔猪。结果发现：口服F18菌毛胶囊疫苗没有明显提高断奶仔猪的血清抗体应答，也不能减少大肠杆菌感染细菌的繁殖，Verdonckde等人研究中也得到了类似的结果[2,5,8]。虽然给哺乳仔猪口服F18阳性大肠杆菌疫苗能取得较好的效果，但胶囊化的F18阳性大肠杆菌在断奶仔猪和哺乳期仔猪都未能显著诱导应答。

胶囊化的F4菌毛能显著减少攻毒后F4阳性ETEC的分泌，但当给哺乳仔猪口服接种F4菌毛培养液时不能取得这样的效果，这表明胶囊化对保护抗原免受胃和小肠前段中酶的降解和失活或受乳汁因子中和有积极作用的，但需进一步优化以提高其作用。一种由高直链淀粉羟甲基淀粉组成的口服片剂可以用来传送F4阳性大肠杆菌或纯化的F4菌毛，可以使细菌有更高的成活率并使F4菌毛在胃肠道中更稳定。抗原的释放处决于片剂从酸性的胃内环境到碱性酶的肠道环境过程中的快速膨胀，触发快速的溶解。分装在Gantrez纳米中的F4胶囊虽然能提高抗F4血清抗体水平，但与溶解的F4菌毛相比不能提高血清抗体应答[9]。

4 注射疫苗的应用

由于乳汁母源抗体的存在，可以用注射用免疫对哺乳仔猪进行疫苗。这些疫苗通常只刺激系统免疫而不作用于粘膜免疫系统。在哺乳期间，肌肉注射福尔马林灭活的F4阳性大肠杆菌可导致免疫抑制。经肌肉免疫1mg F4菌毛能诱导系统IgA应答。当疫苗剂量降到0.1mg时，引起的应答反应更强，这提示除免疫途径外，抗原剂量在诱导血清IgA应答中也起着很重要的作用。此外，用小规模无菌猪进行试验发现，肌肉注射融合蛋白FaeG-FedF-LT192A2:B可诱导血清、粪便和肠道冲洗物中IgA抗体的产生，这样可以中和CT，抑制F4和F8的粘附而保护猪只。融合蛋白的使用可以用来研发多价苗来抵抗ETEC诱导的断奶后仔猪腹泻。维生素D3作为免疫调节因子，可以用来调节系统对肠粘膜IgA的应答。联合肌肉注射维生素D3和抗原可使派尔集结淋巴结中IgA ASC数量的增加。在第8天和第25天时用F4菌毛肌内免疫哺乳仔猪，在第33天攻毒后能减少粪便排泄物，当维生素D3增加时这种作用更明显[10]。

5 结语

ETEC一直是引起断奶仔猪腹泻的重要原因，在养猪生产中导致严重的经济损失，其致病与F4或F8密切相关。当感染时，在小肠中特异的F4和F8 sIgA应答可防止细菌增殖。目前，几个口服疫苗包括亚单位苗和口服活苗在断奶仔猪中取得了较好的效果。由于F4阳性ETEC引起仔猪腹泻一般发生在断奶后的3～10天，因此在哺乳期间免疫更理想。胶囊化的亚甲基苗和口服活疫苗可以克服疫苗在胃肠道中被降解，还可防止被母源抗体和/或其他乳汁因子中和，但目前应用效果不佳。用注射用疫苗是另外一种可行的预防途径，但用于母猪的注射用疫苗倾向于刺激全身的而不是局部粘膜免疫系统。虽然注射免疫后可诱导系统的IgA应答和肠道IgA抗体产生，但在ETEC感染时，有效的ETEC免疫通常也需要GALT中特异性抗体IgA ASC的存在。维生素D3作为一种免疫调节因子在小鼠中取得了好的效果，但当应用于哺乳仔猪时并没有获得保护性的粘膜免疫。因此，在注射免疫中，胶囊化的活疫苗和免疫调节剂的联合使用可以克服哺乳期注射疫苗带来的问题，但仍需进一步的研究。□

[1]Jeyasingham MD,Butly P,King TP,Begbie R,Kelly D:Escherichia coli K88 receptor expression in intestine of disease-susceptible weaned pigs [J].Veterinary Microbiology,1999,68(3-4):219-234.

[2]Melkebeek V,Goddeeris BM,Cox E:ETEC vaccination in pigs[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2013,152(1-2):37-42.

[3]Fairbrother JM,Nadeau E,Gyles CL:Escherichia coli in postweaning diarrhea in pigs:an update on bacterial types,pathogenesis,and prevention strategies[J].Animal Health Research Reviews,2005,6(1):17-39.

[4]Joensuu JJ,Verdonck F,Ehrstrm A,Peltola M,Siljander-Rasi H,Nuutila AM,Oksman-Caldentey KM,Teeri TH,Cox E,Goddeeris BM,Niklander-Teeri V.F4(K88)fimbrial adhesin FaeG expressed in alfalfa reduces F4+enterotoxigenic Escherichia coli excretion in weaned piglets[J].Vaccine,2006,24(13):2387-2394.

[5]Verdonck F,Tiels P,van Gog K,Goddeeris BM,Lycke N,Clements J,Cox E:Mucosal immunization of piglets with purified F18 fimbriae does not protect against F18+Escherichia coli infection[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2007,120(3-4):69-79.

[6]Bozi F,Lackovi G,Stokes CR,Valpoti I:Recruitment of intestinal CD45RA+and CD45RC+cells induced by a candidate oral vaccine against porcine post-weaning colibacillosis[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2002,86(3-4):137-146.

[7]Coddens A,Verdonck F,Mulinge M,Goyvaerts E,Miry C,Goddeeris B,Duchateau L,Cox E:The possibility of positive selection for both F18(+)Escherichia coli and stress resistant pigs opens new perspectives for pig breeding[J].Veterinary Microbiology,2008,126(1-3):210-215.

[8]Felder CB,Vorlaender N,Gander B,Merkle HP,Bertschinger HU:Microencapsulated enterotoxigenic Escherichia coli and detached fimbriae for peroral vaccination of pigs[J].Vaccine,2000,19(7-8):706-715.

[9]CalinescuC,Nadeau E,Mulhbacher J,Fairbrother JM,Mateescu MA:Carboxymethyl high amylose starch for F4 fimbriae gastro-resistant oral formulation[J].International Journal of Pharmaceutics,2007,343(1-2):18-25.

[10]Van der Stede Y,Cox E,Verdonck F,Vancaeneghem S,Goddeeris BM:Reduced faecal excretion of F4+-E coli by the intramuscular immunisation of suckling piglets by the addition of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 or CpG-oligodeoxynucleotides[J].Vaccine,2003,21(9-10):1023-1032.

S858.28

A

1006-4907（2014）03-0001-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.001

杨佳亮(1990～），女，在读硕士，主要从事重大疫病防控工作，E-mail∶YJL900521@126.com。※ 通讯作者：杨青，qingyanghn@hunau.edu.cn。

2014-03-15