哺乳动物精原干细胞研究进展及应用展望

张 炜，任有蛇，张春香

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801)

雄性动物性成熟后，睾丸内能够源源不断地进行精子发生，并形成连续的精子发生波产生大量精子。精子发生(spermatogenes)是精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs) 在相关因子及信号的调控下分化增殖产生大量精子的有序而精确的生理过程。因此，精原干细胞在遗传信息从体细胞向单倍体雄性配子传递的过程中承担着重要的作用［1］。而且精原干细胞是出生后哺乳动物体内唯一能够将其自身的遗传物质传递给后代的细胞类群［2］。作为精子发生过程中最原始最幼稚的前体细胞，对于雄性哺乳动物的精子发生至关重要。对SSCs 的相关研究是近年来干细胞及相关基础科学理论及技术研究中新兴的热点。

精原干细胞的鉴定分离及体外培养是进行其相关研究的重要手段。但精原干细胞本身的一些缺点，如在成体睾丸内所占的比例极低，而且对SSCs 的表面和相关分子标记的研究还不是非常明确。因此，对雄性动物生殖干细胞更加深入的研究和应用仍然存在许多技术难点。近年来，随着细胞分离及体外培养、移植技术的发展及应用，人们已经能够高效筛选并富集特定动物的SSCs，同时也为雄性生殖生理研究提供了新的方法和技术［3］。本文阐述了精原干细胞的形态和生物学特征、增殖及分化相关的调控机理、鉴别的特异性标记物等方面的研究进展，同时讨论了SSCs 在动物繁殖技术与生殖临床医学方面的应用前景。

1 哺乳动物精原干细胞的生物学特点

1.1 精原干细胞的来源及形态学特征

精原干细胞存在于雄性哺乳动物精子发生的场所——睾丸，位于曲细精管基底膜，朝向曲细精管管腔的一侧有赛托利细胞(sertoli cell) 覆盖。精原干细胞的前体细胞是起源于胚胎外胚层的原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs) ，PGCs 自尿囊基部沿后肠迁移至胚胎两侧的生殖嵴并被赛托利细胞的前体细胞包围，之后与赛托利细胞一并形成生殖索。之后原始生殖细胞发育为精母细胞，待个体性成熟后通过各级分化最终产生具有生殖功能的精子［4］。SSCs 较睾丸内的其他体细胞个体大，形态通常近似为圆形或椭圆形，细胞核较大，核仁常位于细胞核的中央; 除线粒体与核糖体含量较高外，胞质中的其余细胞器不发达，细胞间有间桥连接。人与小鼠的精原干细胞直径为10～12 μm，猪为20 ～25 μm。SSCs 生长状态良好时可见胞质透明，颗粒较少，细胞核不明显，且常见2 个或多个精原干细胞［5］。

1.2 精原干细胞在精子发生过程中的变化及相关特征

根据核仁在细胞核中的位置及染色质的形态，一般可以将精原细胞分为A、B 两型，A 型精原细胞细胞核中核仁常靠近核膜，在每个曲细精管的横断面一般有7 ～8 个A 型精原细胞，细胞直径为9 ～10 μm，细胞核直径大约为6.5 ～7.5 μm，核内多均值染色质，染色质较小; B 型精原细胞核仁位于细胞核的中央，染色质较A 型精原细胞粗大。在精子发生过程中，A 型精原细胞通过不断地分裂增殖，一部分保留为A 型精原细胞且保留干细胞的特征; 另一部分则转化为B 型精原细胞，进而继续分化为各级精母细胞并最终形成精子。根据A 型精原细胞在曲细精管及赛托利细胞上的局部排列特征，又可将其分为单个型A-single(As) 、对称型A-paired(Apr) 及链状排列型A-aligned(Aal)三种类型。通常认为，在非灵长类动物，真正的精原干细胞实际上是As(A single) 型精原细胞。As 精原细胞能够通过自我更新或不对称分化产生子代细胞，这些子代细胞通过细胞间桥相互连接形成Apr 型双细胞体，Apr 细胞对进一步分化产生Aal 型线状细胞群体［6，7］。Aal 型细胞群体进一步分化成A1型精原细胞，再经6 次有丝分裂形成A2、A3、A4、In 和B 型精原细胞［8］。

1.3 精原干细胞在动物体内存在的微环境

精原干细胞(SSCs) 位于动物睾丸的生精上皮基底部，数量很少，仅占精原细胞的0.03 %左右。最近的研究表明，干细胞在有机体内生存定居并依赖其发挥生理功能的特异性细胞外环境称为“龛”［9］。在精原干细胞的龛内不仅有SSCs，还存在着SSCs 的前体细胞，这些前体细胞有人将其称为祖细胞。有研究表明，SSCs 龛境的结构及生理特征对龛境内的SSCs 及其前体细胞有最直接的影响［10］。在雄性哺乳动物的睾丸内，以赛托利细胞、曲细精管周围的肌样细胞及基膜围绕所形成的框架构成了精原干细胞的龛境。而部分学者仅将睾丸中存在SSCs 的曲细精管定义为SSCs 的龛境［11］。位于龛境中的SSCs 可以保持其特定的可塑性，SSCs 一旦离开龛境，就会失去其自身特有的自我更新能力而启动向各级精原细胞的分化程序，SSCs 经分化最终形成具有正常功能的精子［12］。精原细胞能够在曲细精管中增殖、分化，表明是SSCs 龛境真正的划界位置在曲细精管的基底膜。因此，区分基底膜及其相关的分子标记，是对精原干细胞进行定位、鉴定和收集的一种重要手段［11］。

曲细精管周围的环境是由许多具有不同生理功能的细胞所构成的间质组织包绕组成的，这样的环境可以为精原干细胞的自我增殖及精子发生过程提供所需的激素及各种生理活性因子。有研究者将小鼠睾丸的支持细胞分离制成细胞悬液并将其注入到不育小鼠受体的曲细精管内，一段时间后，可以检测到受体小鼠重新生成了具有正常功能的精子并使雌性成功受孕。以上研究表明，睾丸中的支持细胞不仅构成了SSCs 龛境的基本框架，而且对精原干细胞的增殖、分化及正常生理功能的发挥和精子发生过程起着不可替代的维持与调控作用。因此，精子发生过程依赖于SSCs 的特异性生理功能，而SSCs 正常生理功能的发挥除了受自身基因特异性表达调控的作用外，还受其所处龛境的直接或间接的调节［13］。

2 精原干细胞自我更新与分化的相关分子机制

SSCs 在哺乳动物体内的自我更新、增殖、分化及发育过程不仅受到自身基因特异性表达调控的影响，还受SSCs 所处内环境的影响。同时，赛托利细胞管周肌样细胞Leydig 细胞及SSCs 本身所分泌的众多生长因子和其他相关调节因子都直接或间接地参与SSCs 的各项生理活动。

2.1 存在于精原干细胞微环境——龛中的相关因子

随着胶质神经源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)的发现，对哺乳动物SSCs 微环境——龛调节机制的深入研究及理解取得了重大进展。GDNF 是转化生长因子- β(transforming growth factor-β，TGF-β) 家族的一个成员，能够促进多种神经元分化并维持其存活［14～17］，同时也是一种具有调节多种细胞株及细胞系发育和分化的多功能信号分子。GDNF 由赛托利细胞产生，是目前唯一所知在调控SSCs 自我更新与增殖过程中起重要作用的旁分泌类型的生长因子［18］。Tadokoro及其同事2002年证明，Sertoli 细胞表达GDNF 依赖于促卵泡素(FSH)［19］。SSCs 在GDNF 的刺激下，能够表达Gfrα-1 和C-Ret 等GDNF 受体。近期的研究结果表明，Akt 信号通路和Src 蛋白激酶家族(SFK) 信号通路均对GDNF 与SSCs 的相互作用发挥调控作用。Akt 信号通路促进SSCs 的均等分裂而导致自我更新，而GDNF 通过SFK 信号通路上调转录因子Bcl6b(B cell CLL/lymphoma 6，member B) 、Etv5(Ets variant gene 5) 与Lhx1(Lim homeobox protein 1) 而间接调控SSCs 生理功能的正常发挥，这些转录因子对SSCs 在体外的存活及维持也有重要作用。

Sertoli 细胞分泌的其他生长因子对SSCs的增殖和自我更新也是必需的［20］，碱性成纤维生长因子(bFGF or FGF2) 和表皮生长因子(EGF) 就是其中最重要的两类。Apert 综合症引起的先天畸形是父系遗传疾病，雄性个体随着年龄的增加而越来越难以生育子代。这一疾病是由于FGF2 受体基因(FGFR2) 发生突变而导致FGF 的功能发生改变。有资料表明，父系的一个SSC 发生突变之后，较其他SSCs 更具有自我更新的优势，从而出现越来越多的突变型SSCs 子代，随着年龄的增长导致越来越多的突变型精子，且这些精子大多没有正常的生殖能力。由此可见，FGFR2 确实在SSC 细胞系中表达，这表明SSCs 中FGFR2 下游的分子信号通路也参与了调节SSC 的分化与自我更新。此外，FGF2也刺激了Sertoli 细胞产生GDNF，间接调控SSCs 的活动［21］。

Sertoli 细胞中含有卵泡刺激素和睾丸酮受体，而卵泡刺激素与睾丸酮是精子发生的主要激素调节因子。精子发生的激素调节包括对Sertoli 细胞的成熟和支持活性的调节，故Sertoli 细胞对于协调精子发生过程至关重要，其功能损伤对精子形成及精原细胞都将产生严重后果［22］。Sertoli 细胞还可以分泌一种能与雄性激素结合的蛋白质，即雄激素结合蛋 白(androgen- binding protoin，ABP) ，使雄性激素在近管腔侧维持较高浓度，形成特殊的微环境，以利于生精细胞正常分化和发育。

2.2 SSCs 分泌的能够促进自我更新的转录因子

拥有luxoid 自发突变型的小鼠睾丸内会出现SSCs 严重缺失的现象。Buaas 等人通过研究发现，前髓细胞性白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger protein，Plzf; ZBTB16) 是luxoid 突变体中的断裂基因［23］。这项发现表明，此基因在对SSCs 的自我更新和分化的调节过程中扮演着重要的角色。As，Apr，Aal 型精原细胞都表达Plzf蛋白。最近的研究发现，Plzf 直接抑制c-Kit 受体在早期精原细胞中的表达［24］。c-Kit 受体从后期的Aal 精原细胞开始表达，在被它的配体干细胞因子(Stem cell factor，SCF) 激活之后，c-Kit 对于从Aal 型精原细胞到A1 型精原细胞的转变过程非常重要［25，26］。可 见，Plzf通过抑制As、Apr 和Aal 型精原细胞中c-Kit 的表达而阻止它们向A1 型细胞的分化。

另一个在SSCs 维持中很重要的转录因子是TATA 框结合蛋白相关因子4b(TATA box- binding protein- associated factor 4b，Taf4b) ，表达于哺乳动物的SSCs 和精母细胞。敲除Taf4b 基因的小鼠，随着年龄的增长，睾丸中SSCs 的数量逐渐下降，最终丧失精子发生能力［27］。

Oatley 等两次研究发现，存在另外一种与Plzf 同家族的锌指蛋白-Bcl6b，其也能抑制SSCs 的分化，并且这一过程受GDNF 的调控［28，29］。Oatley 等研究发现，两种新的转录因子-Etv5 和Lhx1 通过调控GDNF 的表达来间接调控SSCs的活性［28～31］。此 外，Etv5 也被发现在Sertoli 细胞中表达，而Etv5在Sertoli 细胞和SSCs 的表达规律还有待研究。但是，通过干扰Sertoli 细胞的功能或直接作用于SSCs 下调Etv5 基因的表达或敲除小鼠etv5 基因后，均表现出SSCs 数量减少的趋势。因此，Etv5 对于SSCs 的维持可能起非常重要的作用［32，33］。

3 哺乳动物精原干细胞的鉴定分选及相关分子标记研究

3.1 哺乳动物精原干细胞鉴定分选方法

精原干细胞的识别与鉴定可依据其形态结构特征和在生精上皮周期中的局部排列位置来进行，但因对SSCs 表面特异性分子标记的研究不够充分，对于离体、分散的精原干细胞的识别仍是有待解决的难题之一。根据形态学特征，我们可以从位于精原干细胞龛境中的细胞群中分辨出A 型、In 型和B 型精原细胞，但不能区别A 型之内的一些细胞类型。对于离体的SSCs 细胞，我们一般将其制成悬液，用免疫标记结合流式细胞技术或免疫磁珠法进行分选。

当需要在体外对SSCs 的行为和特性进行进一步的研究时，第一步便是分离纯化这些具有自我更新与分化能力的细胞。因SSCs在动物性成熟后会分化出大量的精原细胞及各级精母细胞，使得SSCs 的鉴别及分选更为困难。因此，在从动物睾丸内获取细胞时，一般尽量采用刚出生或出生后不久的个体，以期获得没有发生分化的高纯度SSCs细胞群。从新生动物的睾丸内获得较为理想纯度SSCs 细胞群的方法大致为: 通过使睾丸局部升温或通过外科手术将睾丸置于腹腔中建立隐睾动物模型，或通过药物注射使SSCs 的分化过程受到抑制，但同时对SSCs的自我增殖没有影响，达到提高睾丸中SSCs比例的目的，从而提高SSCs 分选的纯度和效果［34，35］。以小鼠为试验动物开展相关研究大多采用对细胞进行免疫标记后通过流式细胞仪分选的方法。相关的技术及方法在小鼠上的研究已较为深入，而在其他动物，尤其是猪、牛、羊这类经济型家畜上，更多采用较为简单的方法，如重力沉降法、Pecoll 法密度梯度分选法，贴壁差速分选法等。

对精原干细胞进行鉴定和分选，不仅需要在相关的技术上不断改进，而且更需要对精原干细胞的相关特异性分子标记进行深入的研究与开发，并不断寻找更加准确有效特异性更强的分子标记。通过以上方式，对精原干细胞的鉴定筛选必定会越来越准确快捷，为开展SSCs 的深入研究提供科学合理的理论基础与技术支撑。

3.2 哺乳动物精原干细胞相关标记物研究进展

SSCs 很难分离，因为SSCs 会分化为很多亚型的精原细胞，且数量极少。为寻找SSCs 的表面特异性标记，研究者通过检测许多与SSCs 相关基因的mRNA 和蛋白的表达情况来进行。随着人们对精原干细胞表面分子标记物更加深入的研究，已经有十几种相关分子标记被发现，在已知分子标记的基础上设计特定的抗体进行免疫组织化学检测，是目前鉴定检测SSCs 比较普遍的方法。

3.2.1 CD9 CD9 是由227 个氨基酸组成的贯通细胞膜的Ⅱ型糖蛋白，属于te-traspans超家族，且在不同类型干细胞的表面普遍表达。Kanatsu-Shinohara 等通过检测SSCs 的细胞外蛋白，发现通过筛选位于曲细精管的基底膜上和间质组织中CD9 的阳性表达可以检测大鼠和小鼠的SSCs。采用这种方法富集到的SSCs 的量较传统方法提高5 ～7 倍［36］。

3.2.2 C-kit 受体 C-kit 是HZ4 猫科肉瘤病毒kit 原癌基因的同源物，称kit 细胞癌基因，因其表达产物能与干细胞因子(SCF)结合而激发可以调节细胞生长的C-kit/SCF信号通路［37］，所以C-kit 又被称为干细胞因子受体。C-kit 受体表达于胚胎干细胞，外周血造血干细胞及雄性动物的精原干细胞，在哺乳动物胚胎时期的原始生殖细胞的迁移分化及出生后精原细胞的增殖分化等过程中起重要的调控作用。

3.2.3 阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)与碱性磷酸酶(ALP) SSEA-1 是存在于胚胎瘤细胞、胚胎干细胞及部分物种胎儿的原始生殖细胞中的一种与细胞迁移分化及表面信息交换有关的多糖基表位抗原［38，39］。SSEA-1 在小鼠胚胎时期即表达于原始生殖细胞的表面，个体出生后在成体组织中同样有不同程度的表达。但随着动物体年龄的增长及不断发育，从SSEA-1 阳性表达细胞群中检测出精原干细胞的比率逐渐降低［40］，所以应尽早进行相关鉴定及分选。尽管如此，SSEA-1 仍然在精原干细胞的鉴定分选中不失为一种特异性的鉴定标记物。

ALP 是广泛分布于动物体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织，能够催化核酸分子脱掉5'磷酸基团的一种酶。在临床医学上，ALP 是用来对生殖细胞肿瘤和睾丸原位癌进行病理学诊断的传统标志物，同时亦可用于对胚胎干细胞及精原干细胞的鉴定分选［41］。采用ALP 为标记物对SSCs 进行鉴别，最经典的方法是显微镜下观察经ALP 染色的细胞群，若视野中有细胞仅存活于细胞间桥且细胞群落呈团状或链状，这样的细胞便可认定为As 型精原细胞(SSCs) 。

3.2.4 胚胎干细胞关键蛋白-4(octamer-4，Oct- 4) 及生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor，GCNF) Oct-4 是胚胎干细胞发育与分化过程中的一种很重要的标志物，属于Pit-Oct-Unc(POU) 转录因子家族，由POU5F1 基因(定位于染色体6p21.3)编码产生［42］。有研究表明，Oct-4 是特异性非常强的干细胞标志物，其在胚胎样干细胞及原始生殖细胞高度表达，但在已经发生分化的组织中表达量有所降低甚至不表达，这表明Oct-4 的表达参与了对干细胞分化的相关调控与维持［43］。Oct-4 作为干细胞的标志物，是维持细胞全能性及部分多能性的转录因子，在成年动物睾丸内的精原干细胞有表达［44］。

GCNF 属于核受体超家族成员。体内外研究表明，Oct-4 作为转录因子受GCNF 的调控。近期的研究证实，小鼠出生后第8 天开始在睾丸内的精原细胞有GCNF 的表达;但在第17 天后的检测中发现，精原细胞的GCNF 检测结果呈阴性，大量的阳性表达定位于粗线期精母细胞及圆形精子细胞，此项研究结果提示，GCNF 对于精子发生过程的“启动”可能起到了十分关键的作用［45］。因此，Oct-4 和GCNF 可以作为特异性标志，用来对哺乳动物的精原干细胞进行鉴定和分选。

3.2.5 胶质细胞源性神经营养因子(GDNFs) GDNF 对调控精原干细胞的增殖及体内稳定起重要作用，是SSCs 进行自我更新和增殖的必须生长因子。因而GNDF 的受体是SSCs 的另外一种重要的表面标记物。

4 精原干细胞的应用及前景展望

自Brinster 等1994年通过在睾丸网对小鼠进行精原干细胞异体移植并成功获得精子［46，47］以来，精原干细胞在基础生理学、动物繁殖学、临床生殖医学及相关领域巨大的应用前景开始受到学者们的高度重视。近年来，随着相关生物技术及医学手段的不断进步，对精原干细胞的研究也在不断深入，并在多方面取得了显著的成果。相关研究的深入与新兴成果的出现，给精原干细胞的应用提供了坚实的理论依据与科学的技术支持。

SSCs 的应用主要有以下几个方面:

4.1 研究精子发生及相关调控过程

动物及人的精子在体内的发生是以SSCs为起点，受多种环境因素及信号调控的复杂且高度精确有序的过程。目前，精子发生过程相关的调控机制仍不为人所知，因而需要研究者进一步深入研究。随着SSCs 体外培养及异源移植技术的发展，为研究精子发生过程提供了新的思路和途径。结合细胞示踪技术，对SSCs 表面的特异性标记物处理后进行移植，可以对供体精原干细胞在受体睾丸内所发生的一系列变化及与其相互作用的微环境进行实时全程监控，为研究精子发生及调控机制提供帮助。

4.2 转基因动物的生产

传统的转基因动物生产都离不开胚胎操作，在操作过程中胚胎会不可避免地遭受损伤，易导致转基因动物生产效率低，生长发育不正常等现象。1994年，Brinster 等对小鼠的精原干细胞进行异体移植获得成功，实现了供体的精原干细胞在受体睾丸内进行精子发生的过程。干细胞在体内增殖分化的效率较高，一个精原干细胞经各级分化最终可以产生4 096 个精子，虽然细胞凋亡会使精子损失75% ～90%，但理论上一个精原干细胞最终可产生400 ～1000 个精子，较胚胎容易获得且成本较低。精原干细胞研究的不断深入给转基因动物的生产提供了全新的空间，用结合了载体、外源基因与标记基因的重组体转染体外培养的精原干细胞，使目的基因整合到精原干细胞的基因组，将细胞传代培养后注入到受体动物的睾丸，使其产生含有目的基因的精子。通过特定的手段将含有外源基因的精子分选出来，并用其进行人工授精以获得含有目的基因的转基因动物。

4.3 保存、重建生殖能力及治疗雄性不育

当今，癌症已经成为困扰人类的头号健康杀手，化疗会对患者造成某些生理机能的损伤，如生殖能力的损伤。接受过化疗的年轻男性患者，其自身的精子发生能力会遭到不可逆转的破坏而导致不育。随着SSCs 冷冻及移植技术的发展，可以在对患者进行治疗之前提取、分离SSCs 并进行冷冻保存及培养，待治疗结束时机适合时，再将其解冻移植回患者睾丸内。有些大动物(如牛) 在同种异体移植实验中发现对植入的精原干细胞有免疫排斥［49］，但也不乏成功的例子，给男性不育的治疗提供了新的思路和技术。

4.4 遗传疾病的诊断与治疗

精原干细胞是动物体内唯一可以将遗传物质传递给自身后代的成体干细胞，其细胞表面的标志物、SSCs 特异性相关分子标记与后代的某些疾病存在相关性，通过对这类标记信号的筛选，可以及早对相关疾病进行诊断。对于存在致病因素的情况，可以对SSCs内的遗传缺陷进行修正后扩大培养细胞株，将修改后的遗传信息固定后，再移植到种畜或存在家族遗传疾病患者的睾丸内以产生不含遗传缺陷的精子并产生正常的后代，从而达到对某些家族遗传病的治疗和遗传缺陷的矫正。

综上所述，现今学术界对精原干细胞的相关研究日趋成熟，但仍有许多未知等待着

我们去研究、发现并揭示现象背后更深层次的机理。随着各项研究工作的深入与技术的进步，精原干细胞的应用将更加科学、更加广泛，在动物繁殖新技术、生殖生理研究和临床医学及濒危物种种质资源保护方面具有广阔应用前景。今后，精原干细胞在生物学及医学相关的领域必将发挥重要且不可替代的作用。

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