抗苗勒氏管激素(AMH)及其在选择供体牛上的应用研究进展

孙凤俊，薛建华，吕小青，张佳谊

(北京奶牛中心 科研中心，北京 延庆 102100)

卵泡的发生和发育不仅受垂体性腺轴调节，与FSH紧密相关，还受卵巢内一些因子的自分泌和旁分泌影响。这些因子主要为转化生长因子(transforming growth factors，TGF)超家族成员，包括颗粒细胞来源的抗苗勒氏管激素(AMH)、颗粒细胞和卵泡膜细胞来源的抑制素和激活素以及卵母细胞来源的生长分化因子-9(GDF9)和骨形态发生蛋白(BMP-15)等等。其中抗苗勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)引起了人们的研究兴趣，AMH又称苗勒管抑制物质(mullerian inhibitory substance，MIS)，只在性腺产生，表达于从初级卵泡到小窦卵泡的颗粒细胞中，在调控卵泡生长和发育中起到了重要的作用。本文就AMH的生理作用及其在牛超数排卵供体牛选择上的应用作一综述。

1 AMH在生理性卵泡形成中的作用

1.1 AMH及其受体在生理性卵泡发育中的表达

在鼠胚卵巢中未检出AMH，但生后4 d即可以在卵巢颗粒细胞中检测到表达，这和初级卵泡开始生长的时间一致[1]。在对鼠的研究中，AMH表达于早期生长卵泡、窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞中，而在始基卵泡、大的窦卵泡、闭锁卵泡和卵母细胞中均无表达[2]。在人类卵巢组织研究中，AMH在36周龄的胎儿卵巢中开始有表达[3]，在始基卵泡上无表达，在74%的初级卵泡的颗粒细胞上弱表达，在次级卵泡、窦前卵泡和4 mm的小窦卵泡中强表达，而在较大的窦卵泡(4～8 mm)中，AMH表达逐渐消失，在>8 mm的卵泡中几乎无表达[4]。人的小窦卵泡(3～8 mm)卵泡液中的AMH是排卵前卵泡的3倍[5]。目前，对AMH受体的研究尚未发现始基卵泡上的表达，故推测AMH可能不直接作用于始基卵泡。AMH型受体在小的生长卵泡的颗粒细胞和卵泡内膜细胞上表达，在较大的窦卵泡和排卵前卵泡的颗粒细胞上无表达，而在较大的窦卵泡和早期闭锁卵泡的卵泡膜细胞上仍继续表达[2，6]。综上，AMH及其受体主要在较小的生长卵泡上表达，这表明AMH主要在早期卵泡的形成中起作用。

1.2 AMH参与卵泡形成的两次重要募集

卵泡形成要经历两次重要募集：起始募集和周期募集。始基卵泡的颗粒细胞呈扁平形，转化为初级卵泡的颗粒细胞呈立方形，此时AMH才开始产生。AMH由初级卵泡产生，通过旁分泌抑制卵泡从始基卵泡池进入生长卵泡池，从而调控起始募集。长期表达AMH的转基因小鼠，胎儿早期卵泡形成明显减少，且很快消失，最终导致性腺发育异常，提示AMH可能抑制始基卵泡启动，导致生长卵泡减少[7]。AMH基因敲除的小鼠，出生时始基卵泡池正常，25 d和4月龄时发现其卵巢含有比野生型更多的生长卵泡，并伴随始基卵泡减少，13个月大时始基卵泡几乎检测不到，窦前和小窦卵泡的数量也减少。即在发情期开始前始基卵泡就开始大量募集，使始基卵泡池过早耗尽，发情周期过早结束。表明缺乏AMH导致始基卵泡大量募集，证实AMH抑制始基卵泡募集的作用[8]。AMH还参与了从生长卵泡到成熟卵泡的另一次重要募集——周期募集。Durlinger等的研究发现，AMH抑制FSH刺激的窦前卵泡生长，而且AMH缺陷鼠无论FSH高或低比野生型有更多卵泡生长[9]，表明AMH缺乏的卵泡对FSH更敏感。每个卵泡因AMH等因子表达不同，FSH阈值不同，窦前和小窦卵泡中AMH的表达差异，影响卵泡对FSH的反应性，从而影响卵泡的选择。AMH低表达的生长卵泡对FSH的反应性高，即降低了FSH阈值，从而被选择，继续生长至下一周期排卵[2]。在正常人类卵巢中，>9 mm的卵泡AMH生成减少，可能这对优势卵泡的选择是必需的[10]。直径2～5 mm的窦卵泡中AMH生成较高，依赖FSH生长，AMH低的卵泡可能优先超出FSH阈值被周期募集了，继续生长至6～9 mm的卵泡，AMH生成减少。

2 牛血浆AMH在选择胚胎供体牛上的应用研究

超数排卵与胚胎移植(MOET)技术目前已广泛应用于牛育种中，然而，可用胚胎数量(即优良胚胎，目前每头超排供体获得6枚)在过去20年时间里没有显著变化[11]。制约MOET技术发展的主要因素是供体牛对超排处理反应存在较大的差异性[12]。

一直以来，人们探讨通过各种方法来预测供体牛胚胎生产能力，用于选择优良供体。然而，到目前还没有简单而又行之有效的方法用于选择优良胚胎供体牛。最近，人们注意力都集中在抗苗勒氏管激素(AMH)为牛卵巢卵泡库和卵泡超排处理反应提供新的信息。最新研究结果表明，抗苗勒氏管激素(AMH)也叫穆勒氏管抑制素(MIS)，特别是小生长卵泡的颗粒细胞所表达的，是牛卵巢对促性腺激素反应卵泡库大小的一种内分泌标记物，可以帮助预测个体牛排卵反应[13，14]。AMH在小有腔卵泡的颗粒细胞中表达高，而卵泡生长末期和闭锁阶段表达下降[15，16]。直径在3～7 mm的卵泡群是超排处理的主要目标，对血浆AMH浓度发挥显著作用，并已经提出处理前检测AMH血浆水平有助于预测超排反应[16]。在许多治疗妇女不排卵性不孕症的临床研究中，已经明确AMH也作为卵巢对FSH处理反应的标记物，其优势是不依赖于所处周期的阶段，而且从周期到周期是可重复的[17～20]。

Danielle Monniaux等[13]通过测定血浆AMH浓度，探讨预测超排供体母牛生产可用胚胎能力。在2004～2008年，研究人员对45头奶牛的胚胎重复生产数据进行回顾性研究分析。每头胚胎供体，单独采血用于AMH检测。在第1次泌乳期采集血样，不考虑母牛所处的发情周期是哪个阶段，还要在胚胎生产开始之前数月进行。对结果进行分析，评估供体胚胎生产数量的可重复性，寻求可能遗传的特性。研究分析AMH血浆测定值与胚胎采集数量或可移植胚胎数量之间的关系。

4年来，45头供体超排处理240头次，生产胚胎2 901枚，其中可用胚胎1 946枚。每头供体牛采集的胚胎总数和可用胚胎数变化范围较大，分别从1枚到50枚和0枚到37枚不等(平均数分别为12.08±0.55和8.11±0.40)。根据供体获得可用胚胎能力(C)将供体牛分为两组，头均获得可用胚胎数量最多定义为高产胚胎供体牛，并将高产胚胎供体牛(优良胚胎供体；C>10；n=32)采集的胚胎(P<0.001)与低产胚胎供体牛(C<10；n=13)采集的胚胎进行比较。然而，高产胚胎供体牛与低产胚胎供体牛之间可用胚胎率(即生产优质胚胎的比例)没有显著差异(分别为68.6%和58.8%；P>0.05)。

分析血浆AMH含量与胚胎生产数量之间的关系，供体母牛血浆AMH含量与每头供体平均获胚胎数和最高胚胎数呈正相关(分别为r=0.49，P<0.001；和r=0.58，P<0.0001)。供体母牛血浆AMH含量100～200 pg/mL组和>200 pg/mL组胚胎生产数量高于血浆AMH含量<100 pg/mL组供体母牛(比较头均获胚胎数和最高胚胎数，对于AMH含量<100 pg/mL组与100～200 pg/mL组供体比较，P<0.05；对于AMH含量<100 pg/mL组与>200 pg/mL组供体比较，P<0.01)。

每头供体平均获可用胚胎数和最高可用胚胎数也与血浆AMH含量相关(r=0.32，P<0.05；r=0.38，P<0.01)。供体母牛血浆AMH含量100～200 pg/mL组和>200 pg/mL组可用胚胎数量高于血浆AMH含量<100 pg/mL组(比较头均获可用胚胎数和最高可用胚胎数，AMH含量<100 pg/mL组与100～200 pg/mL组和200 pg/mL组供体比较，P<0.05)。生产可用胚胎能力高的供体母牛血浆AMH含量是生产可用胚胎能力低的供体母牛血浆AMH含量的2倍(分别为190.1±21.3 pg/mL和93.2±17.2 pg/mL，P<0.01)。

3 应用与展望

Danielle Monniaux等[13]的研究结果表明，根据AMH浓度有助于选择获得优良可用胚胎的供体牛。在哺乳动物中，卵泡是AMH的独有来源[18]。而且，在母牛中已经发现，AMH是促性腺激素敏感的小有腔卵泡数量的可靠内分泌标记[16]。有报道，在女性中，血浆AMH浓度不依赖于月经周期的阶段，从周期到周期相对恒定[17～20]。此外，最近研究结果表明，奶牛个体血浆AMH浓度稳定数月，这是每头母牛长期特点[16]。总之，这些研究结果表明，血浆AMH浓度不表现重要变异性，说明AMH可以作为预测高产或低产胚胎能力供体的理想候选方法。

Danielle Monniaux等[13]的研究结果进一步证明了AMH含量与超排后采集的胚胎数和可用胚胎数之间呈显著相关。同时，供体母牛胚胎生产能力是可重复的，可能遗传的性状。而且，该研究结果为根据测定供体母牛血浆AMH含量确定具备生产可用胚胎潜在能力的供体提供简单的预测方法。然而，需要进一步的研究评估确定进行血液检测的最佳时间，并根据动物年龄、发情周期的阶段、卵泡波和身体状况、以及确定将用于选择的优良和较差胚胎供体的血浆AMH浓度临界值。

随着对AMH检测技术的不断发展和在奶牛繁殖技术应用的深入研究，检测牛血浆AMH含量不断成熟，并将广泛应用于优良种牛胚胎供体的选择，为胚胎移植技术发展发挥重要作用。

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