绿茶提取物EGCG抑制致龋菌变形链球菌生长、产酸的实验研究

陈秀兰

(咸宁市中心医院口腔科，湖北咸宁437100)

龋病俗称虫牙、蛀牙，是细菌性疾病，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。如不及时治疗，病变继续发展，形成龋洞，终至牙冠完全破坏消失，其发展的最终结果是牙齿丧失。龋病特点是发病率高，分布广。现已证实，变形链球菌(S.mutans)是引起龋齿的重要病原菌，其通过粘附于牙面获得性膜上，繁殖、产酸，溶解牙体硬组织，形成龋洞。茶多酚是茶叶中一类以儿茶素为主体的多酚类化合物，是茶叶水溶液提取物的主要成分。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，是茶多酚生物活性的主要成份。研究显示，绿茶中儿茶素对引起人体致病的部分细菌有抑制效果，本实验的目的就是研究绿茶提取物茶多酚对变形链球菌生长、产酸能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 EGCG购自Sigma公司，变形链球菌购自武汉大学口腔医学院口腔医学工程教育部重点实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌液的准备 细菌复苏及培养:将变形链球菌干菌株复苏并接种于脑心浸液琼脂培养基(Brain Heart Infusion，BHI)，在37℃厌氧环境下(CO210%、N290%)培养48h，经形态学鉴定后挑取接种于BHI液体培养基中培养48h增菌，使用BHI液体培养基调节菌液浓度，使其达到5×106CFU/ml，备用。

1.2.2 抗菌药物EGCG混悬液的配制 EGCG用BHI液体培养基配制成0.1%的母液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后于4℃避光保存，使用前按设定浓度(100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5 mg/L)用BHI培养基稀释后使用。

1.2.3 抑菌环试验接种 取直径为5mm的无菌干燥的滤纸，滴加EGCG混悬液20μl，将滤纸片平放于清洁的无菌平皿中，置室温下自然干燥备用。阴性对照样片的制备方法相同，只是滴加的是同等体积的无菌生理盐水。以无菌棉分别蘸取已制备好的变形链球菌液均匀涂布于BHI琼脂平板表面，涂布4次，每次旋转平板 90°，最后沿平板边缘涂抹1圈，置室温干燥5 min。用无菌镊子将含不同浓度药纸物的纸片贴于含菌平板上。将平板置37℃恒温箱中培养48 h，用游标卡尺测量培养皿中的圆形抑菌区域直径并取得平均值。

1.2.4 EGCG对变形链球菌的最低抑菌浓度(MIC)用BHI培养液按液体二倍稀释法进行等倍稀释，配制浓度为 100、50、25、12.5、6.25、3.13mg/L各9ml置于无菌试管中。在每管中加入1ml菌悬液，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。阴性对照组试管中为BHI培养基9ml，1ml菌液，空白对照组试管中为10ml BHI培养基。每组5个平行样。以肉眼观察药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的最低抑菌浓度。

1.2.5 EGCG对变形链球菌的产酸抑制作用根据EGCG对变形链球菌的MIC测定结果，选取MIC值以下的4个浓度(1、1/2，1/4和1/8 MIC)，配制成含1%蔗糖的BHI培养液，对照组为不含EGCG的BHI培养基，每组5个平行样。采用精密pH计调定初始pH为7.4，各组按菌悬液和BHI液体培养基1∶10比例接种等量菌悬液，厌氧培养48h，测定上清液pH值，每管测定3次，结果取平均值，并计算pH变化值(△pH)。

1.3 统计学分析 各浓度药物对细菌产酸抑制作用的研究数据采用SPSS13.0统计软件分析，多组均数间比较选用单因素方差分析，多组间均数两两比较用LSD-t检验。

2 结果

2.1 不同浓度EGCG对变形链球菌的抑菌圈大小 结果显示 100mg/L、50mg/L、25mg/L和12.5mg/L EGCG对变形链球菌的抑菌圈的直径大小分别为14.02±0.98、12.98±0.77、11.54±0.62和10.12±0.37mm。单因素方差分析及LSD-t检验结果显示均数间两两比较差异存在显著性(P＜0.05)。

2.2 肉眼观察EGCG对变形链球菌的最低抑菌肉眼观察EGCG对变形链球菌的最低抑菌浓度为6.25 mg/L。

2.3 不同浓度EGCG对变形链球菌产酸的抑制作用 结果显示两实验组(6.25 mg/L、3.13mg/L)△pH值均小于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。并且多组间均数两两比较显示6.25 mg/L、3.13mg/L两组之间差异存在显著性(P＜0.05)。

3 讨论

茶是我国最早发现的中草药之一。中医认为，绿茶性苦寒，具清热解毒，去火降暑 、利尿消炎、消毒杀菌和止渴生津的功效［1］。绿茶提取物的主要成分包括茶多酚、碳水化合物以及多种维生素等，EGCG是茶多酚最主要的活性成分。目前许多研究证实，绿茶提取物具有降血压、抗凝血、降血糖、减肥、防治动脉粥样硬化、预防皮肤过敏效应等多种药理功能。除此之外，还能预防龋齿、牙周炎、口臭等功效［2］。埃及科学家在2008年3月举行的普通微生物学第162次会议上说，饮绿茶可帮助抗菌素杀伤对抗菌素有极强耐受性的超级细菌，使这些抗菌素效力提高3倍以上。报告显示接受抗菌素时喝绿茶是耐受菌，甚至是超级耐受菌对几乎所有受试抗菌素的抵抗力降低。本实验证实绿茶提取物EGCG具有抑制龋齿主要病原菌变形链球菌增殖的作用。抑菌圈实验结果表明EGCG对变形链球菌有显著的抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑菌圈直径越大，提示药物浓度与抑菌作用呈正相关趋势。最低抑菌浓度为6.25 mg/L，说明当只要药物浓度≥6.25 mg/L就能显著抑制变形链球菌的增殖。除此之外，本实验还检测了不同浓度EGCG对变形链球菌产酸能力的影响。结果显示当浓度≥3.13mg/L时，EGCG对变形链球菌产酸有一定的抑制作用，当药物浓度≤1.56mg/L时，实验组与对照组的△pH相比较差异没有统计学意义。

由此可见，绿茶提取物EGCG具有显著抑制变形链球菌增殖、产酸的作用。EGCG可能是一种潜在的天然抗菌、防龋药物。中国是产茶大国，以茶叶为原料提取茶多酚极具特色和优势，作为茶叶生产的新型副产品，具有相当大的经济效益。

［1］顾谦，陆锦时，叶宝存.茶叶化学［M］.合肥:中国科学技术大学出版社，2005:348

［2］孙树国.绿茶提取物市场前景广阔［J］.食品开发，2013，28(2):42