LncRNA的结构研究及进展

郭春霞 刘会

·综述与讲座·

LncRNA的结构研究及进展

郭春霞 刘会

长链非编码RNA；结构；研究；进展

近年发现的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在细胞生长、发育、表观遗传学以及肿瘤和心血管疾病发生过程中，发挥重要的调控作用[1-9]。LncRNAs长度为1 000～10 000个碱基，通常是多聚腺苷酸化的，受RNA聚合酶Ⅱ催化转录合成[3，6，7]。LncRNAs主要分布于胞核，在胞浆中也有存在。很多lncRNAs与组蛋白修饰、染色质重塑和表观遗传效应有关[10]。但是，表观遗传因子识别它们的作用机制仍然是个谜。在哺乳动物的基因组中，lncRNAs的重要性已引起研究者的重视，lncRNAs可能在DNA、组蛋白和甲基化作用因子之间提供了一个新的表观遗传桥梁。本文综述了近年在lncRNAs研究方面取得的进展。在人类基因组中，超过70%的基因可进行转录[11]，但蛋白编码基因仅占其中的1%～2%。具有转录活性的非蛋白编码基因大部分(80%～90%)是lncRNAs[12]。基于lncRNAs的两个主要特征，它通常被定义为：(1)转录本长度(>200 nt)；(2)翻译能力很低或缺失[13]。一些lncRNAs(“macroRNA”)的长度很长，能延伸至90 kB，如108 kB的Air和91 kB的kcnqlot1[14]。根据距离蛋白编码基因的相对位置，lncRNA可进一步被分为不同类型：天然反义转录本(NAT)是从蛋白编码基因的反义链转录而来，至少在一个外显子区有基因重叠；大插入式非编码RNA，即已知的长链基因间非编码RNA(lincRNA)，距离蛋白编码基因很远；内含子编码RNA是独特的从蛋白编码基因的内含子区转录而来，既能从正义，也能从反义方向转录；双向lncRNAs是从蛋白编码基因启动子区反向转录而来。由于lncRNAs具有细胞特异性、组织特异性、发育阶段特异性和疾病特异性，想要对它们的数量进行精确的评估十分困难。在人体组织中，最新估算lncRNAs的数量达到了15 000[15]。然而，仅2012年就发现了上万个新的lncRNAs。有关lncRNAs的机制研究有可能比核糖体更具挑战性，因为lncRNAs并不是高度保守，也不是高表达的。虽然如此，RNA分子在它们的序列、二级结构或三级结构上的一系列功能元件是已被公认的。RNA干扰和RNA沉默能序列特异性地控制基因表达。核糖体开关RNA通过二级结构调节基因表达。核糖体通过其复杂的三级结构合成蛋白质。LncRNAs也可能通过这三种方式中的某一种调控基因表达。研究发现，lncRNAs系统中可能存在所有这三种机制，用现代结构生物学技术能得到大量有用的信息。虽然有关lncRNAs三级结构的研究还远未完成，但是通过其它已知RNA的晶体结构，能推测它们在lncRNAs分子中出现的可能性。

1 LncRNAs序列元件

一些lncRNAs分子序列上存在着与DNA直接相互作用的区域。在某些情况下，RNA和DNA之间发生Watson-Crick碱基配对，而在某些情况下，二者之间的相互作用又符合三股螺旋机制[16]。

1.1 miRNA-解离lncRNAs 这些lncRNAs的序列上存在miRNA选择性的结合位点，可调节蛋白编码基因转录后表达水平。Linc-MD1参与肌肉分化，作为一种竞争性的内源性RNA，能使miR-133和miR-135与它们的靶基因解离[17]。

1.2 半-STAU1结合位点RNA(1/2-sbsRNA) 这种lncRNAs通过Alu元件和mRNA的3’-UTR结合参与STAU1-介导的mRNA降解[7]。lncRNAs的Alu元件和mRNA的Alu元件之间发生不完全配对。这种相互作用可以被dsRNA结合蛋白STAU1所识别，从而介导mRNA降解。

1.3 反义lncRNAs 这些lncRNAs可与mRNA结合，并调节它们的剪接。长链非编码Zeb2NAT的转录本，源于Zeb2 mRNA的5’剪接位点的反义序列，能阻止该区域的剪接，保留了其含有的核糖体进入位点，从而保证了该蛋白的有效翻译。

1.4 上游lncRNAs 这些lncRNAs可与DNA启动子区形成三螺旋复合物。来源于人二氢叶酸还原酶(DHFR)上游的lncRNAs，使上游转录起始于次要启动子位点，导致转录因子与主要启动子的结合减少，进而抑制基因表达[18]。此外，这些源于上游的非编码RNA产物可以与DNA主要启动子位点直接相互作用，形成一个嘌呤-嘌呤-嘧啶三螺旋体。

2 LncRNAs二级结构元件

除了核酸序列以外，二级和三级结构在决定lncRNAs的作用模式中也起到了核心作用，它能发生特异性的结合、变构、及催化作用。

2.1 染色质重物中的双茎环 很多lncRNAs在染色质重构中都发挥着重要作用，通常和染色质修饰酶类反式结合[19]。Zhao等[20]发现，在小鼠胚胎干细胞中有>9，000的lncRNAs，并和多梳抑制复合物2(PRC2)相互作用。电泳迁移率转变实验(EMSA)分析显示，PRC2通过其四个多梳蛋白结构域之一的EZH2与lncRNAs相互作用，而它三个结构域蛋白能进一步加固这种相互作用。包括RepA/Xist、HOTAIR和Air的大量经过鉴定的lncRNAs表明，lncRNAs中整个PRC2-相互作用家族都存在某些共同的特征。此外，lncRNAs也能与LSD1/CoREST/REST复合物结合，这在H3K4去甲基化中极为关键。LincRNA HOTAIR是具有这种双功能的典型例子[3]。

HOTAIR长2.2 kB，能通过招募LSD1和PRC2组蛋白修饰复合物到靶基因位点调控HoxD和许多其他基因的表达。HOTAIR的删除实验结果表明，以下两个结构域参与这种相互作用：(1)5’端的300 nt区域与PRC2结合；(2)3’末端下游的646 nt区域与LSD1结合。由于这两个关键基序存在于HOTAIR的5’和3’末端，那么二者中间的这段序列究竟有什么功能。这段间隔序列是以空间组织的方式为两个相互作用的位点提供所需的距离；还是它含有靶向作用所需要的基序，或者含有其他尚未发现的活化所需的其他蛋白的结合基序呢？在PRC2结合结构域内曾发现一个双茎环RNA基序。有关LSD1的结合基序内还未发现类似的通用二级结构[20]。

类似于HOTAIR，Xist的一个由该区域的重复序列编码，能结合PRC2的重复亚区，长期以来被认为能形成多个双茎环结构[21]。最近详尽的化学分析结果与假设的二级结构元件的排布并不相符，这表明存在一个更为复杂的二次折叠，包括延长的螺旋亚结构域[22]。这需要另外一些有关PRC2与lncRNA相互作用的详细结构/功能的研究完成以后，与PRC2相互作用的关键的RNA模序才能明确。

2.2 3’末端的三叶草结构与大脑发育：在lncRNAs很多不同的区域都发现了与tRNA类似的三叶草二级结构。它参与了lncRNAs的3’末端成熟及其亚细胞排布[23]。这包括MALAT1和Neat1，分别与核斑点及核副斑点的形成有关。在非规范成熟的MALAT1的3’末端有一个三叶草的二级元件。这个亚区在MALAT1和Neat1序列中都是最保守的元件，为tRNA-样结构模式。这个结构元件负责为分裂和产生成熟的MALAT1转录本并招募RNase P(与tRNA分子成熟有关)。剩余的分裂片段被RNase Z/tRNA核苷转移酶进一步处理，生成一个tRNA-样转录本(mascRNA)，然后进一步穿梭到胞质。具有类似3’末端加工机制的还有Neat1v2转录本，也能产生小的、独立的tRNA-样分子，被称为menRNA[24]。

有趣的是，在另一个lncRNA HAR1(人类加速区)的亚区也发现了三叶草结构。HAR1与新大脑皮层发育有关[25]。这个区域覆盖了118个核苷酸，在脊椎动物中高度保守(在鸡和黑猩猩中有2 nt的改变)，但是在人体内有较大的差异(相对黑猩猩有18个突变)[26]。在体外对人(hHAR)和黑猩猩HAR(cHAR)区域进行结构探测实验发现了不同的二次折叠[25]。在黑猩猩中，cHAR采用一种相对不稳定的、扩展的发夹结构；而在人体中，hHAR折叠成一种三叶草结构，其中包括一个4-向连接。

2.3 类固醇激素受体活化中的二级结构 有研究发现，SRA(类固醇激素受体激活剂)能共激活多个类固醇激素受体(如ER、AR、TR、GR、RAR)，并和很多蛋白直接相互作用(如SHARP、SLIRP、DAX-1、TR)，这表明它在转录复合物中可能起到了脚手架的作用。还有研究表明SRA也和CTCF相互作用[27]。它是在人体中首次发现的lncRNAs之一。生化检测显示，它呈复杂的2D结构，由四个主要的亚结构域组成，从小的螺旋区域到复杂的多路节点都有二级结构。总的来说，SRA包含25个螺旋片段，16个终端回路，15个内部循环和5个交界区。同时，嘌呤富集区是高度保守的，且常位于单链区，如末端，中间和连接回路。采用多序列比对进行统计分析表明，在整个脊椎动物中，这个结构中存在大量的螺旋。

3 以往研究的其它RNA系统的三级结构

迄今为止，还没确定lncRNAs的三级结构。在此以以往发现的其他RNA的结构作为参考，并以lncRNAs为背景进行讨论。概括地说，RNA的三级结构大致包括tRNA、各种核酶和配体RNA、Ⅰ类和Ⅱ类内含子、RNA单环和四联体、细菌核糖体的组分以及剪接体的组成元件。于2000年最初公布的核糖体的高分辨结构，引发了大量其他RNA的晶体学研究，包括各种的核糖开关RNA，TLS RNA，RNase P，信号识别颗粒，HIV-1移码元件，端粒酶RNA区域，以及很多其它的核糖体组分[28]。然而迄今为止，得到高分辨率晶体结构的大RNA(>200 nt)仍然只有核糖体和内含子。

Ⅰ类和Ⅱ类内含子是从大量RNA茎环形成的RNA螺旋帽状结构为特征的致密RNA分子中分离出来的[29，30]。这些螺旋通过各种节点连接在一起。在螺旋、循环和节点之间还存在三级连接。

端粒末端转移酶复合物的一个重要组分是端粒末端转移酶RNA，它直接与端粒末端转移酶逆转录酶结合，作为核苷酸加入到末端着丝粒区域的模板。人端粒酶RNA由450 nt组成。在酵母中发现，est1p在RNA上的结合区域并不固定，可发生移动，并且其功能的不受影响，这表明端粒酶RNA的区域是高度可变的[31]。

RNase P是一个核糖核酸酶，负责从tRNA上剪切下一个前体序列。结构主要由RNA决定[32]。小蛋白分子元件能增加tRNA与RNase P的亲和力。这个RNA是高度结构化的，且结构紧密，类似于Ⅰ类和Ⅱ类内含子。

在蛋白质的合成中，核糖体是普遍保守的分子[33]。在细菌中，核糖体由两个亚基组成。小亚基(30S)包括一个1.5 kB的RNA(16S rRNA)和20种不同的蛋白。大亚基(50S)包括一个3 kB的RNA(23S rRNA)，一个120 nt组成的RNA(5S rRNA)和35中不同的蛋白。这两个亚基结合在一起，在中间形成一个大的空间，tRNA能从这里进出。多数的蛋白质因子在GTP相关中心或三个tRNA结合位点中的一个上与核糖体结合。例如，EF-Tu和EF-G在延伸循环的不同阶段都能结合到核糖体的相同位点上。核糖体结构的支架是RNA，然而很多蛋白质散在穿插分布于核糖体各处，提供结构稳定性的总体支架。功能因子能通过GTP-依赖方式保证核糖体在蛋白合成过程中的顺利前进，并在蛋白质合成的不同阶段介导核糖体的进入与解离。

4 高分子复合物和lncRNAs的空间相互作用

到目前为止，NEAT1转录本的发现为lncRNAs参与四元复合物形成提供了主要证据。由同一个启动子表达产生两个表达水平相似的Neat1亚型(Neat1V1：3.7 kB和Neat1V2：22.7 kB)[34]。两种亚型都与特异性细胞核结构核副斑点的形成有关。这些核糖核蛋白复合物的主要特征是具有三个不同的、都含有RNA-结合基序的蛋白质(如p54，PSF和PSP1)[35]。核副斑点模型的形成有赖于初始Neat1V2与PSF及p54结合，之后伴随发生PSP1和Neat1V1募集反应的发生[34]。无论是Neat1V2、p54还是PSF1缺失，都会导致核副斑点崩解；然而，PSP1的缺失并不影响这个结构。免疫杂交和原位杂交的电子显微镜研究显示，核副斑点的缔合需要与多个Neat1转录本结合，形成一个纤维样网络[36]。

使用特异性针对Neat1亚区的探针发现，Neat1的5’和3’末端主要分布在核副斑点的外围，而较长的Neat1(Neat1V2)转录本中央区域形成核副斑点的内部部分。核副斑点形成的直径相对固定，但长度有很大变化。小鼠Neat1转录本的直径对应于人的要短9%(2 kB)，由此得出一个结论：Neat1转录本的长度也是这种排列长度的一个限制因素。然而，Neat1在核副斑点中最终如何完成排列仍不清楚。有可能是Neat1转录本之间通过RNA-RNA相互作用，形成一个大分子复合物平台。此外，蛋白质可以作为多个Neat1V2转录本连接的桥梁，特别是已经知道p54能与PSF及PSP1蛋白形成异二聚体。

5 LncRNAs结构和机制的展望

5.1 LncRNAs可能不存在于核糖体样核糖核蛋白复合物中 核糖体是迄今为止已发现的唯一结构>1 kB的RNA，那么，lncRNAs与核糖体在结构组成上是否有相似之处？最近对类固醇激素受体RNA激活剂(SRA)lncRNA结构研究显示，在整体结构上，RNA的二级结构与核糖体相似。目前，没有关于SRA lncRNA或其它lncRNAs三级结构的信息，也不清楚lncRNAs是存在于核糖核蛋白复合物中(RNPs)，还是作为独立的RNA。

通过与核糖体相比，发现了一些含有特异性蛋白质的长RNA复合物。在人类基因组中，蛋白编码基因的总数据估计能达到21 000[37]。由于多数蛋白质都存在于细胞质中，由此推测胞核中蛋白的数量，即Nproteinnucl<21 000。而已鉴定lncRNAs多数位于细胞核中，据保守估计，NlncRNA，nucl>3 000，由此 NlncRNA，nucl/Nprotein，nucl>1/7。很多lncRNAs与核糖体大小相当甚至比核糖体还大。以核糖体本身为例，每一个亚基中RNA分子与蛋白分子的比例NrRNA/Nrp约为1/25。因此，在人类基因组中，即使每一个特异性编码蛋白都与一个lncRNAs形成一个复合物，lncRNAs在结构组成上能仍然不可能与核糖体相似。没有足够的特异性蛋白质能让每一个lncRNAs都形成核糖体样复合物。因此，存在于胞核中的lncRNAs不太可能存在于核糖体样RNP复合物中。

5.2 大量的lncRNAs可能形成与端粒酶RNA、RNase P以及Ⅰ类、Ⅱ类内含子结构类似的复合物 尽管据推测lncRNAs复合物的结构与核糖体不同，但却并不排除它与RNase P、端粒酶RNA或Ⅰ类和Ⅱ类内含子相似。以“RNase P样”复合物为例，lncRNAs是高度结构化和紧密的，含有一个主要的蛋白结合位点，能与各种蛋白结合。实验证实，SRA的二级结构是高度组织化的，提示它很可能具有这种结构；而某些lncRNAs结构分散，没有一个紧密的核心，它可能含有几个不同的蛋白结合位点，作为具有柔韧性的绳索结构，该结构与端粒酶RNA类似[31]；而另一些lncRNAs也可能是一个独立的、高度结构化的RNA，与Ⅰ类和Ⅱ类内含子相似。这种lncRNAs可能只是在需要的时候与蛋白短暂地结合；也可能存在一些高度无序的lncRNAs，含有松散的蛋白结合结构域。

5.3 LncRNAs可能的结构机制 基于RNA分子的序列、二级及三级结构，出现了多元化的RNA机制，以及它们的组合机制。在以序列为基础的机制，如siRNA介导的RNA干扰和miRNA介导的RNA沉默中，RNA起到了非常微小的结构作用。其主要作用是增加这些进程的序列特异性，让RISC复合物找到它的作用靶点，进而触发一个主要以蛋白为基础的调节机制。

在过去的十年中，出现了一个新的调节机制，这个机制几乎完全是基于RNA的二级结构[38-40]。在核糖开关RNA系统中，两个二级结构彼此竞争以控制转录的终止，一个代谢产物的存在与否各选择这两种结构中的一种，决定了开关基因表达的启闭。例如，在SAM-I核糖开关中，代谢产物(SAM)的存在能引起RNA折叠成一个紧密的配体，有利于转录终止子螺旋结构的形成，从而关闭SAM合成酶的基因表达。在缺乏该代谢产物时，形成另一种螺旋结构，抑制转录终止子螺旋结构的形成，开启基因表达。

以RNA三级结构为基础的往往是变构机制，可称为“诱导契合”或“构象选择”[41]。在诱导契合中，一个事件，如蛋白或配体结合，能引起一个大的构象变化。蛋白或配体的结合将打破两种构象形成的动态平衡，而趋向于形成其中一种。以核糖体为例，不同构象的涨落常常同时存在于在不同的时相。蛋白结合或GTP水解使这种波动同步，推动不同构象间动态平衡与能量变化相适应，使核糖体在延伸周期中顺利前进[42，43]。

5.4 事件的时相和顺序 除了lncRNAs的三级结构，事件的顺序和这些系统的动力学对于了解机制也是必不可缺的。例如，很多核糖体复合物的结构已经被阐明，然而核糖体易位的机制仍然不明确。快速动力学研究确定了这些事件发生的整体顺序[44]。单分子研究有助于阐明状态转换的机制。而要完全阐明机制则需要结合结构和动力学双重方面的信息。

以lncRNAdBE-T为例说明在lncRNAs机制中可能涉及的时相，lncRNAdBE-T是表观遗传开关的一个关键组成部分，与肩肱型肌营养不良症(FSHD)有关。该lncRNA具有顺式作用，能在染色质上募集表观遗传因子D4Z4和Ash1L到DBE(D4Z4结合元件)上，促进组蛋白甲基化及4q35基因转录。这些事件的顺序可能是：(1)转录；(2)lncRNA折叠；(3)表观遗传蛋白结合到lncRNA；(4)表观遗传蛋白与染色质结合；(5)表观遗传蛋白发挥作用(如组蛋白的甲基化)。其中每个步骤都有相应的时程。鉴别限速步骤对于理解lncRNAs的作用机制有重要意义。不同类型的lncRNAs，发生的分子事件可能完全不同。

6 LncRNAs与人类疾病的关系

lncRNA的表达非常广泛，它们在很多生理过程中都起到关键作用，包括基因组的全局调节，因此，它们参与了多种人类疾病的发生发展。

6.1 癌症 LncRNAs在控制细胞周期、细胞凋亡和抑制肿瘤过程中起到举足轻重的作用。LncRNAs ANRIL调节三个独立的抑癌基因p16INK4a、p14ARF和P15INK4B，是细胞周期重要的负调控因子[45]。破坏ANRIL的表达会促进多种肿瘤的发生，包括神经母细胞瘤、急性淋巴细胞性白血病、黑色素瘤[45]和前列腺癌。HOTAIR转录物是一种与HOXD基因簇有关的cis-lncRNA，当其过表达时，会反向调节HOXD的表达，引起肝癌、大肠癌和乳腺癌。卵巢癌和乳腺癌与LSINCT5 lncRNA的表达有关。该转录物可作用于其它几种转录物，包括反义RNA Neat1和PSPC1基因，二者可编码一种剪接调节因子[46]。在MALAT1过表达诱导的非小细胞型肺癌中，存在lncRNAs相关的可变剪切功能障碍。

6.2 代谢性疾病 虽然对于lncRNAs在代谢性疾病中的作用知之甚少，但是有研究表明，某些lncRNAs是新陈代谢和内分泌功能的重要调节器。其中naPINK最近备受关注，它是PINK1 [PTEN(10号染色体上缺失磷酸酶和张力蛋白)诱导假定激酶1]的反义转录本。正如它的名字一样，PINK1受PTEN诱导，是胰岛素信号通路的重要抑制剂。PINK1的缺失与糖尿病状态、神经元细胞株葡萄糖摄取受损、脂肪细胞线粒体基因表达有关[47]，naPINK1破坏，可能会影响葡萄糖代谢。同样，已知的反义转录物H19/IGF2和甲状腺生长因子受体α2(ERBa2)可能能调节他们的内分泌和代谢功能[48]。在脂代谢基因中同样涉及到lncRNAs。据报道[48]，△5脱氢酶(FADS1)和急性类固醇合成调节蛋白(STAR)基因均存在lncRNAs。在动物模型中发现，膳食脂肪含量对FADS的表达及其lncRNAs，反式D5-脱氢酶的调节是相反的。在食欲控制中也涉及到lncRNAs；最近证实，人生长素(GRHL)基因的lncRNAs能促进摄食行为。这些结果表明，lncRNAs表达异常会影响肥胖。

6.3 神经退行性疾病和精神疾病 在AD的病因中涉及到BACE1的反义转录本，BACE1AS[49]。AD的一些特征是由于大脑中β-淀粉样斑块的聚积造成的。BACE1基因是一种完整的膜肽酶A1糖蛋白，在β-淀粉样斑块的聚积过程中起到关键作用。BACE1是两个对急性期蛋白进行初步水解的肽酶之一，并使之在大脑中积聚。BACE1AS的水平在患有AD的受试人群中含量较高，在AD转基因小鼠模型中含量同样较高[49]。

在精神性疾病中也有关于lncRNAs的报道。“中断的精神分裂症1”DISC1基因座的中断与精神分裂症、情感性分裂症、双相情感障碍、重症抑郁及自闭症有关。DISC1受其lncRNAdISC2的调节，后者可能也是这些失调症状的易感因素。精神分裂症谱系和AD也与RELN基因及其反义转录本HAR1有关[50]。

6.4 心血管疾病、高血压和中风 LncRNAs有可能会影响心血管疾病和高血压。许多前瞻性研究发现，影响ANRIL转录本表达的遗传变异与中风的风险和复发有关。在高血压中，七个血压候选基因(ADD3、NPPA、ATP1A1、NPR2、CYP17A1、ACSM3和SLC14A2)与cis-lncRNA转录本有关。一般利尿钠肽前体A(NPPA)的基因产物仅在胎儿心房和心室肌细胞表达，但发现其在表现出肥厚和心力衰竭的患者中也有再活化[51]，因此被认为是心脏疾病的标志物。NPPA-AS lncRNA被认为是NPPA基因选择性剪接的调节器。这个lncRNA有可能与心血管疾病有关。

6.5 免疫功能障碍和自我免疫 研究发现，lncRNAs在控制先天性免疫信号系统中有重要作用[52]。通过对四个不同品系的小鼠研究发现，当发生病毒性感染时，在免疫应答过程中，有近500个lncRNAs的表达发生改变[52]。细胞应激可激活生长阻滞特异转录本5(growth arrest specific 5，Gas5)，通过糖皮质激素受体作用于不同的基因，并且是细胞凋亡的重要调节因素。在小鼠模型中Gas5与系统性红斑狼疮的易感性增加有关，可能与它与糖皮质激素的免疫抑制作用有关。还有研究发现，在未经治疗的Graves’病的患者中，反义RNA Heg与CD14de水平和甲状腺自身抗体有关。

近年，在生物学的不同领域发现了上千种新lncRNAs，很可能会揭示出一系列不同的结构和结构机制。这些机制可能基于lncRNAs序列、二级结构、三级结构，或基于这几者的共同作用。LncRNAs结构的多元化将伴随着一系列相应的动力学机制。由于RNA分子难以进行结晶，很有必要用一些替代方案来获取lncRNAs的三维信息。确定lncRNAs共有的结构特征和结构/功能关系，将有助于我们理解lncRNAs在发育和疾病中的作用，为以lncRNAs为基础的治疗策略的制定奠定基础。

LncRNAs成为真核转录的一个重要组成部分，参与70 %基因表达的调节。和多种生理学进程，如表观遗传的调控、染色质重塑和mRNA可变加工等，从而密切参与并控制重要的生理过程。它们对于多种高级功能的调控，为未来的疾病治疗开辟了一个令人激动的新领域。

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