中国南方地区马尔尼菲青霉分子流行病学初步研究

赵 亮，唐秀文，王梅竹，曹 煜，牟丽丽，金 方，李小玲，陈玉如，康颖倩

马尔尼菲青霉菌 (Penicilliummarneffei，PM)主要侵犯免疫受损的人群，引起马尔尼菲青霉病(penicilliosis marneffei，PSM)。该病主要在东南亚地区流行，如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港等，在流行地区，马尔尼菲青霉菌病已成为继结核病和隐球菌性脑膜炎之后的第三大机会性感染，并已成为东南亚国家HIV感染的指征性疾病[1]。我国以广西、广东地区多见，但近年来，两广以外的省份也出现感染病例。为了进一步探索该真菌在不同地区的分布特点及分子流行病学特点。本文采用了微卫星基因分型法(multilocus microsatellite typing，MLMT)对贵州及广西、广东地区的马尔尼菲青霉菌临床株进行了分型和对比研究。

1 材料与方法

1.1菌株来源 通过贵州省贵阳市传染病院HIV感染科，广西壮族自治区龙潭医院检验科，广州孙逸仙医院等从贵州省，广西省，广东省各地区病人血液、皮肤分泌物中分离马尔尼菲青霉菌菌株共50株，其中贵州省16株，广西省29株，广东省5株。

1.2培养基和试剂 PDA培养基(Difco Laboratories)，CTAB(四川金山制药公司)，PCR试剂盒(Fermentas公司)，Taq-DNA 多聚酶(上海生工)。

1.3菌株分离与形态学鉴定 将贵州收集到的标本及获赠自广西、广东的菌株接种于PDA培养基上，37 ℃培养，划线法分离纯化马尔尼菲青霉菌，挑取单个菌落传代保存，分别于25 ℃及37 ℃观察马尔尼菲青霉菌的菌丝相及酵母相形态特点。

1.4DNA提取 将50株马尔尼菲青霉菌接种于PDA培养基，37 ℃培养72 h，收集培养物，采用玻璃珠法和CTAB法[2]提取马尔尼菲青霉菌的DNA，吸光度法检测DNA浓度，并稀释成1 μg/μL冷冻备用。

1.5ITS检测与鉴定 以ITS4、ITS5为引物，用PCR试剂盒在25 μL反应体系中扩增，上、下游引物及DNA各1 μL，反应条件为预变性94 ℃ 5 min，然后变性94 ℃ 30 s、退火50 ℃30 s、延伸72 ℃1 min循环35次，最后72 ℃延伸10 min，将产物于1.5%琼脂糖中电泳后在紫外灯下观察，并将扩增产物进行测序。

1.6微卫星基因分型

1.6.1引物合成 根据文献[3]，选择具有6个以上二核苷酸重复单位的微卫星位点AL684924 ( PMMI),AL686035 ( PMMII), AL684847 ( PMMIII)，合成引物，每对引物上游5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记。

1.6.2微卫星序列分析 用合成的3对引物对50株PM基因组DNA分别进行扩增。50 μL PCR反应体系为，DNA模版4 μL，引物0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，10×PCR缓冲液5 μL，Taq-DNA 多聚酶2.5 U，MgCl22 mmol/L。PCR反应条件，96 ℃预变性4 min，然后变性95 ℃30 s、退火58 ℃30 s、延伸72 ℃30 s循环35次，最后72 ℃延伸30 min，将产物于1.5%琼脂糖中电泳后在紫外灯下观察。扩增样品冷冻送于上海生工公司进行毛细管电泳，通过Genescan软件分析计算等位基因大小。根据序列长度，分离株可被分为不同基因型。

1.7聚类分析 应用SPSS18.0软件聚类分析法处理等位基因数据，自动生成谱系聚类树状示意图。

2 结 果

2.1菌株分离与观察 贵州共分离到16株，以及获赠自广西地区的29株及广东的5株，共50株马尔尼菲青霉菌，37 ℃培养72 h形成乳白色酵母型菌落，25 ℃培养72 h形成青绿色丝状菌落，并产生酒红色色素(图1)。

图1PDA培养基上的马尔尼菲青霉菌菌落

Fig.1ColoniesofP.marneffeionPDAsolidmedium

a:P.marneffeicolonies (yeast form) growing at 37 ℃ for 72 hours;

b:P.marneffeicolony (filamentous form) growing at 25 ℃ for 72 hours

2.2ITS序列分析 将ITS序列测序结果在Pubmed 基因库中搜索对比，鉴定菌种，结果显示所收集菌株均为马尔尼菲青霉菌。

2.3微卫星分型 结果显示50株马尔尼菲青霉菌的每个位点均可以观察到一个简单的PCR扩增产物，说明培养物中没有混杂的PM菌株。PCR产物大小用Genescan软件分析，如图2所示，蓝色主峰即为标记的等位基因大小。

微卫星引物PMMI 、PMMII、PMMIII分析检测到的等位基因见表1，50个样本共检测到47个微卫星型(PMMT)。贵州检测到14个型，相同型别的菌株有Gypm2、Gypm3和Gypm15，均属于PMMT2型；广州检测到4个型，相同的有Sums0851、Sums0107,均属于PMMT18型；广西检测到29个型。如图3A所示，PMMI区分度最高，共检测到29个不同大小的等位基因,散在分布于158～245 bp内，分布频率最高的是192 bp和189 bp的等位基因，各有6株(各为12%)，其中含192 bp等位基因的菌株于3个地区都有分布，而含189 bp等位基因的菌株均来自贵州。PMMII检测到9个不同的等位基因，分布在148～158 bp之间，如图3B所示，分布频率较高的等位基因型是150 bp、149 bp和153 bp,分别有16(32%)、13(26%)和10(20%)株，3个地区共有的等位基因是148 bp和153 bp。PMIII检测到8个不同的等位基因，分布在213～225 bp内，如图3C所示，分布频率最高的是218 bp、216 bp和214 bp，分别有17(34%)、16(32%)和9(18%)株，其中216 bp和218 bp是三个地区共有的等位基因。

图2马尔尼菲青霉菌Sums0851毛细管电泳图

Fig.2CapillaryelectrophoresispatternsofP.marneffeistrainSums0851

A: PMMI; B: PMM II; C: PMMIII

图350株马尔尼菲青霉菌的等位基因在贵州、广西和广东地区的分布特点

Fig.3Alleledistributioncharacteristicsfor50P.marneffeistrainsobtainedfromGuizhou,GuangxiandGuangdong

A: PMMI; B: PMMII; C: PMMIII

表1 PM菌株来源地理区域、等位基因大小、微卫星分型

根据欧式距离 ( Euclidean distance )[4]可将贵州、广西、广东临床分离的马尔尼菲青霉菌分为6大类(Cluster1～ Cluster6)，谱系聚类树状图如图4所示，Cluster1共9株(18%)，包括3株广东株和6株广西株；Cluster2共8株(16%)，均为广西株；Cluster3共27株(54%)，包括13株贵州株、13株广西株和1株广东株；Cluster4共3株(6%)，包括1株贵州株和2株广西株；Cluster5共2株(4%)，为贵州株和广东株各1株；Cluster6仅1株(2%)贵州株。

图450株马尔尼菲青霉菌的聚类分析树状图

Fig.4Phenogramtreeconstructionwith50P.marneffeistrains

Strains named Gypm- obtained from Guizhou; strains named Sums- obtained from Guangxi; strains named Gxpm- and A00- obtained from Guangxi.

3 讨 论

马尔尼菲青霉菌是一种温度依赖性双相真菌，在37 ℃生长形成酵母样菌落，在25 ℃生长形成丝状菌落，并产生酒红色色素。竹鼠是该菌的天然宿主，有研究[5]认为竹鼠是该病重要的传染源，也有[6]推测接触流行区的含菌土壤可引起人感染，具体传播途径尚待明确。在我国最早以广西省最多见[7]，近年来，随着艾滋病的增多，PM引起的感染在云南、北京、福建、四川等省相继出现报道，且呈上升趋势。说明我国PM感染逐渐跨越了原来的流行区域，但相关分子流行病学研究尚存不足。早期应用于PM分子流行病学研究的RFLP、RAPD等[8-9]方法，区分度较低，重复性较差。目前微卫星序列分型法(MLMT)以其高度多态性和高分辨率被广泛应用于群体遗传学和分子流行病学分析中。Fisher等[10]用23个微卫星位点对来自不同流行国家的PM临床分离株进行分析，提示PM的地区分布与种群基因结构存在相关性。Lasker和Ran等[3]应用3个微卫星位点对流行地区PM的相关研究也获得相似推论。为进一步了解PM的流行特征，本研究通过对来自我国南方地区贵州、广东和广西的马尔尼菲青霉菌临床菌株微卫星多态性研究，以从微生态遗传基因层面揭示该菌的分子流行病学特点及其与地域间的联系。

本研究共收集并鉴定了来自贵州、广西和广东的马尔尼菲青霉临床株50株。AL684924 (PMMI)、AL686035 (PMMII)、AL684847 (PMMIII)3个微卫星位点分别检测到29、9和8种不同大小的等位基因，组合3个基因将50株PM分为47个微卫星型(PMMT1～PMMT47)。说明贵州、广西和广东分布的马尔尼菲青霉存在着较高的基因多态性。进一步分析各微卫星位点在3个地区的分布，发现PMMI集中在158～245 bp之间，分布以189 bp(12%)和192 bp(12%)比例最高，PMMII集中在148～158 bp之间，分布以150 bp(32%)、149 bp(26%)和153 bp(20%)为主，PMMIII集中在213～225 bp内，分布以218 bp(34%)、216 bp(32%)和214 bp(18%)为主，对比还发现3个地区间微卫星位点均存在相同的等位基因分布。而根据等位基因聚类分析结果，3个地区PM临床株分为6类，其中54%属于Cluster3，Cluster1和Cluster2分别占18%和16%，Cluster4 、Cluster5 和Cluster6分布较少。以上结果分析显示贵州、广东和广西的马尔尼菲青霉微卫星型具有一定的地区分布规律和相关性，这可能与贵州、广东和广西都位于我国南方地区，且位置邻近有关，本研究结果再次说明马尔尼菲青霉的种群基因结构与地域分布之间存在着一定的相关性。但这种相关性是否与相邻地区间菌株迁徙以及地区间的疾病传播有关，则需扩大样本量及采样范围进一步研究。另外，我们还在同一地区内发现了相同的微卫星型和个别分布比较特殊的等位基因(如含PMMI 189 bp等位基因的菌株均来自贵州)，这是否意味着PM的分布还存在地区同源性和遗传差异性，均有待于补充更多标本后进一步研究明确。

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