基于地理信息系统的青海省鼠疫菌毒力研究

熊浩明，魏柏青，祁美英，李存香，杨晓艳，辛有全，魏荣杰，靳 娟，代瑞霞

青海省位于青藏高原东北部，东经89°35′～103°04′，北纬31°40′～39°19′，东西长1 200 km，南北宽800 km，面积72.12万km2。属于高原大陆性气候，具有气温低、昼夜温差大、降雨少而集中、日照长、太阳辐射强等特点。有喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地和青海田鼠鼠疫自然疫源地2种类型的疫源地，是我国鼠疫危害最严重的地区之一。不同类型的鼠疫自然疫源地由于地理分布、主要宿主动物以及鼠疫菌的生化性状不同,鼠疫菌的毒力也存在差异。本文对青海省分离的392珠鼠疫菌进行毒力测定，并输入青海省地方病防治地理信息系统数据库，用QHEndem ic-GIS软件对青海省392株鼠疫菌毒力的空间分布进行描述和分析，以便为青海省鼠疫防治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1菌株来源 以1954-2012年青海省内不同地区、宿主、媒介体内分离的鼠疫菌392株作为实验对象。所有菌株均由青海省国家鼠疫菌种保藏中心提供。

1.2实验动物 昆明系小白鼠(以下简称小鼠), 体重18～20 g，购自青海省实验动物中心。

1.3毒力测定 将每株菌的37 ℃24 h培养物用灭菌生理盐水制成菌悬液，菌悬液原液浓度大于20亿个菌/mL，用标准比浊管比浊稀释成7亿个菌/mL，计算制成的菌悬液原液的实际浓度，稀释为2×101个菌/mL、2×102个菌/mL、2×103个菌/mL、2×104个菌/mL、2×105个菌/mL、2×106个菌/mL、2×107个菌/mL、2×108个菌/mL、2×109个菌/mL。剂量组小鼠皮下注射0.5 mL，每组5只，攻毒剂量为101个菌、102个菌、103个菌、104个菌、105个菌、106个菌、107个菌、108个菌、109个菌。同时用100个菌接种平皿，28 ℃培养72 h计算其活菌数。小鼠观察饲养14 d，死亡的小鼠当天解剖，取肝、脾做细菌培养和鼠疫噬菌体裂解试验，培养出鼠疫菌者为特异性死亡，否则为非特异性死亡。用SPSS 21.0软件计算每株鼠疫菌对小鼠的半数致死量(LD50)和95%的可信范围[1]。

1.4QHEndem ic-GIS数据库的建立和制图 将每株鼠疫菌分离的宿主、媒介、分离地点、地理编码、输入数据库。用QHEndem ic-GIS软件导入数据库数据后，用青海省地图按照不同的制图要求进行参数字段分类并赋予相应的颜色显示，插入图例和标题后输出。

2 结 果

2.1毒力测定结果及空间分布 青海省392株鼠疫菌对小鼠毒力测定结果：LD50小于100的菌株有323珠，占82.39%；LD50大于等于100小于1 000的菌株有44珠，占11.22%；LD50大于等于1 000小于10 000的菌株有10珠，占2.55%；LD50大于等于10 000的菌株有15珠，占2.55%。其中LD50大于等于1亿的菌株有5珠，占1.27%，分布于共和县、兴海县、格尔木市和都兰县，分离宿主为人尸体、喜马拉雅旱獭和五趾跳鼠。青海省各地区392珠鼠疫菌对小鼠LD50结果见表1，LD50小于1 000的强毒菌有367株占测毒数量的93.62%。将测毒数据导入数据库后用QHEndem ic-GIS软件对鼠疫菌LD50小于100和小于1 000的菌株数空间分布图见图1、2。

2.2青海省鼠疫菌不同生态型毒力 青海省各地区392株鼠疫菌按照不同生态型(生态型分类依据文献[2])菌株分类统计LD50结果见表2，将青藏高原型菌株和祁连山型菌株的LD50数据输入SPSS21.0，用SPSS 21.0计算青藏高原型菌株LD50分布为正态分布，均数为166458.224，标准差为2626588.49；祁连山型菌株LD50分布为正态分布，均数为81.785，标准差为294.19。用SPSS 21.0做两独立样本秩和检验，检验类型选择“Mann Whitney U”Z值为-1.687，P<0.01，故认为两种生态型菌株LD50间有显著性差异。青海田鼠型和其他生态型菌株因抽样比例较少未做LD50比较。

图1LD50小于100的鼠疫菌株空间分布

Fig.1SpatialdistributionofLD50<100Yersiniapestisstrains

图2LD50大于等于100小于1000鼠疫菌株空间分布

Fig.2Spatialdistributionof100≤LD50<1000Yersiniapestisstrains

3 讨 论

鼠疫菌与其他病原微生物一样, 不同疫源地的鼠疫菌的毒力有明显的差异, 因此, 毒力也作为鼠疫菌分型的一个重要指标[3]。张春华等[4]指出以往工作中鼠疫菌毒力测定中存在概念混淆，将LD100误说为MLD[4]，推荐更加适用的半数致死量(LD50)计算方法[4]。朱锦沁等[5]用小鼠对鼠疫菌毒力的划分为：MLD在1万或l万以下为强毒菌，MLD大于1万小于10万为中等毒力菌，100亿菌尚不能完全致死小白鼠的为自然弱毒菌，这是对鼠疫菌毒力最早的划分。黄坚华等[6]参考我国生物制品规定中鼠疫菌安全生产试验标准，将我国的鼠疫菌的毒力分为4种类型，即强毒株、中等毒株、低毒株和弱毒株。目前关于鼠疫菌毒力的划分还没有统一的标准，应按照LD50确定鼠疫菌的毒力划分较为准确。按照青海省392株鼠疫菌对小鼠毒力测定结果，LD50小于1 000的鼠疫菌株应划分为鼠疫强毒株，占93.62%(367/392)；LD50大于等于1 000小于10 000的鼠疫菌株为鼠疫中等毒力株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于10 000小于1亿的鼠疫菌株为鼠疫低毒株，占2.55%(10/392)；LD50大于等于1亿的鼠疫菌株为弱毒株，占1.27%(5/392)。本次试验发现毒力变异的弱毒株5株，有1株分离于人尸体中，1株分离于五趾跳鼠，3株分离于喜马拉雅旱獭。王丽[7]等在青海“三江源”地区调查发现，部分在疫源地居住的居民进入疫源地务工及捕食旱獭的人员血清存在鼠疫抗体，血清抗体滴度普遍不高。浙江、广西、广东、河北、陕西、青海等省市均发现健康人群鼠疫F1抗体阳性情况[7-12]，本次毒力测定过程中发现5株鼠疫菌半数致死量大于1亿，这或许应成为健康人群血清存在鼠疫抗体的一个研究方向。不同生态类型疫源地的菌株毒力存在明显的差异，本次毒力测定发现祁连山型菌株毒力比青藏高原型菌株毒力强，两者菌株LD50有显著性差异。青海田鼠型因地区局限，分离菌株数量少，本次研究抽样较少，未做LD50比较。

表1 青海省各地区392株鼠疫菌对小鼠LD50结果

表2 青海省各地区392株不同生态型鼠疫菌对小鼠LD50结果

从图上可以看出，青海省鼠疫菌绝大多数属于鼠疫强度株，鼠疫强毒株分布覆盖了青海省大部分面积。青海省鼠疫以强毒株为主，鼠疫病型易由腺鼠疫转化为肺鼠疫，应进一步加强动物鼠疫监测，防止人间鼠疫发生。建立青海省鼠疫自然疫源地鼠疫菌毒力基础数据，可供其他学者后续研究参考。

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