慢性HBV感染患者血清IL-35含量和外周血Treg细胞的变化及意义

刘志华，齐青松，张志安，张晓静

（广东医学院附属厚街医院感染科，广东东莞 523945）

慢性HBV感染患者血清IL-35含量和外周血Treg细胞的变化及意义

刘志华，齐青松，张志安，张晓静

（广东医学院附属厚街医院感染科，广东东莞 523945）

目的研究血清IL-35和外周血Treg细胞含量在慢性乙型肝炎(HBV)患者中的作用及意义。方法选取广东医学院附属厚街医院感染科慢性HBV感染患者40例[(其中慢性乙肝无症状携带者(AsC)8例，慢性乙肝轻、中度患者(CHB-LM)20例和慢性乙肝重型患者(CSHB)12例]作为实验组。同时选取本院体检科健康志愿者(HV)15例作为对照组。采用ELISA方法检测血清IL-35含量，流式细胞术检测外周血Treg细胞含量，Pearson相关分析两者的相关性。结果HBV患者血清IL-35含量[(75.00±6.75)pg/ml]显著高于健康志愿者血清IL-35含量[(44.13±4.49)pg/ml]，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。CSHB组和CHB-LM组血清IL-35含量均明显高于AsC组(P＜0.05)；CSHB组和CHB-LM组间血清IL-35含量差异无统计学意义(P＞0.05)。HBV患者外周血Treg细胞含量[(6.45±0.42)%]显著高于健康志愿者外周血Treg细胞含量[(3.07±0.31)%]，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。CSHB组Treg细胞含量明显高于CHB-LM组和AsC组Treg细胞含量(P均＜0.05)。CHB-LM组Treg细胞含量明显高于AsC组Treg细胞含量(P＜0.05)。HBV患者血清IL-35含量与外周血Treg细胞含量呈正相关(P＜0.05)。结论血清IL-35和外周血Treg细胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病阶段存在差异，可能在HBV发生、发展过程中发挥重要作用。

调节性T细胞；白细胞介素 35；慢性乙型肝炎

急性和慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染仍是重要的全球性健康问题，目前全球仍约有4亿慢性HBV感染者[1]。适应性免疫应答反应在慢性HBV感染中起着至关重要的作用，特别是Th17/Treg细胞的平衡关系与HBV感染疾病进展及预后关系密切[2]。免疫抑制性细胞因子IL-35具有扩增并促进Treg分化，抑制Th17细胞亚群分化、增殖，防止过度自身免疫反应等的作用[3]。近年来，越来越多的研究也表明Treg细胞在自身免疫性疾病及慢性感染性疾病中扮演更重要的作用[2，4]。目前国内外关于IL-35在肝病尤其是HBV感染致病机制中的研究尚少。因此，本文以慢性HBV感染患者为研究对象，旨在研究IL-35和Treg细胞在慢性乙型肝炎患者中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2011年8月至2012年10月于我院感染科确诊的慢性乙型肝炎病毒患者40例及同期体检科健康志愿者(Healthy volunteers，HV)15例作为对照组。40例HBV患者中男性23例，年龄20～55岁，平均(32±1.4)岁；女性17例，年龄22～58岁，平均(33±1.7)岁；15例HV组中男性9例，年龄20～45岁，平均(30±1.3)岁；女性6例，年龄20～40岁，平均(31±1.5)岁；各组男女比例及年龄比较差异均无统计学意义。根据疾病进展程度患者组分为三组，即慢性乙肝无症状携带者(Asymptomatic carriers of chronic hepatitis B，AsC)8例；慢性乙肝轻、中度患者(Chronic hepatitis B with low and moderate patients，CHB-LM) 20例和慢性乙肝重型患者(Chronic severe hepatitis B，CSHB)12例。所有研究对象均无合并HIV感染、其他肝炎病毒感染、真菌或细菌感染、自身免疫性肝病和肝细胞癌等。所有患者1年内均未使用核苷类似物或者干扰素抗病毒治疗。所有对象均采用肝素管空腹采血5 ml。

1.2 样本处理将采集的5 ml血1 000 r/min，离心5 min后收集上清，以100 μl每管保存于-80℃冰箱用于ELISA检测。以两倍体积的Hanks缓冲液稀释细胞沉淀后，用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)用于流式细胞分析。

1.3 ELISA检测血清IL-35含量采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清IL-35水平，IL-35试剂盒购买于上海蓝基(BG)公司提供，操作步骤按照说明书进行，检测仪器为MK3-酶标仪(芬兰)。

1.4 流式细胞术检测外周血Treg含量PBMC分离后，将细胞悬浮于含2%小牛血清的1640培养液中，台盼蓝染色、计数后，采用eBioscience公司的Treg试剂盒检测外周血调节性T细胞含量，具体操作步骤按说明书进行。同时采用同型对照管确保抗体特异性染色，抗体标记完后的细胞用FACS CantoII流式细胞仪检测，用Flow Jo软件对检测结果进行分析。

1.5 统计学方法采用Graphpad prism5.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间差异性检验采用t检验；计数资料差异性检验采用χ2检验。采用Pearson相关分析血清IL-35含量与外周血Treg含量的相关性。检验水准均为P＜0.05。

2 结果

2.1 血清IL-35含量检测结果ELISA检测40例HBV患者和15例健康志愿者(HV组)血清IL-35含量，结果显示HBV患者血清IL-35的含量[(75.00±6.75)pg/ml]显著高于健康志愿者血清IL-35含量[(44.13±4.49)pg/ml]，两者比较差异有统计学意义(t=2.705，P=0.0092)。CSHB组[(89.47±15.75)pg/ml]和CHB-LM组血清IL-35含量[(78.42±8.49)pg/ml]均明显高于AsC组[(44.83±4.15)pg/ml]，差异均有统计学意义(t=2.258，P=0.036 6；t=2.432，P=0.022 2)；CSHB组和CHB-LM组间血清IL-35含量差异无统计学意义(P＞0.05)；AsC组和HV组间血清IL-35含量差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 外周血Treg细胞含量检测结果流式细胞术检测40例HBV患者和15例健康志愿者外周血Treg细胞含量，结果显示HBV患者外周血Treg细胞含量[(6.45±0.42)%]显著高于健康志愿者外周血Treg细胞含量[(3.07±0.31)%]，两者比较差异有统计学意义(t=4.784，P＜0.000 1)。CSHB组Treg细胞含量[(8.85±0.68)%]明显高于CHB-LM组[(6.02±0.43)%]和AsC组Treg细胞含量[(3.93±0.49)%]，两两比较差异均有统计学意义(t=3.692，P=0.000 9；t=5.310，P＜0.000 1)。CHB-LM组Treg细胞含量明显高于AsC组Treg细胞含量，两者比较差异有统计学意义(t= 2.775，P=0.010 1)。AsC组和HV组间外周血Treg细胞含量之间差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 相关性分析Pearson相关性分析显示，HBV患者血清IL-35含量与外周血Treg细胞含量呈正相关(r=0.340，P=0.031 8)。特别在慢性乙肝重型患者(CSHB)中两者相关性更为显著(r=0.822，P＜0.01)。

3 讨论

我国携带HBV人数占全世界HBV携带总数的1/3。乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝病毒，当人体感染HBV病毒后可引起一系列复杂的免疫反应，特别是细胞免疫反应应答紊乱。因此，细胞免疫应答是决定机体HBV感染后转归的最重要因素，尤其是CD4+T细胞各亚群平衡的紊乱[2，5]。

Treg细胞作为免疫调节细胞在HBV感染发病机制中的作用越来越受到重视，特别是Treg细胞能够抑制机体过度免疫损伤，但也有利于HBV持续感染，使机体表现为免疫耐受状态[6]。IL-35属于IL-12家族新成员，是一种免疫抑制性细胞因子，也是Treg细胞主要分泌的几大免疫抑制性细胞因子(IL-10，TGF-β和IL-35)之一。IL-35由EBl3和p35亚基组成异源二聚体，在抑制效应T细胞增殖、Th17细胞分化和IL-17的合成方面发挥重要作用。研究证实，IL-35在自身免疫性疾病和感染性疾病的发生、发展中也具有一定的抑制作用[3]。研究还认为Treg在体内可能通过IL-35诱导Treg细胞为iTR35，从而发挥抗感染作用[7-8]。本研究中，我们发现HBV患者者外周血中IL-35水平显著高于健康志愿者，这与国内石银月等[9]的结果相似。本研究我们还显示慢性乙肝重型患者血清IL-35和外周血Treg细胞含量尤为增高。值得注意的是，HBV患者血清IL-35含量与外周血Treg细胞含量呈正相关，特别在慢性乙肝重型患者(CSHB)中两者相关性更为显著。我们推测，IL-35可能协作Treg细胞参与机体抗感染自身免疫功能的调节。

目前Th17/Treg细胞平衡关系的研究已是当前HBV疾病进展的研究热点。有研究认为Th17和Treg细胞可能是由同一个前体细胞分化而来[10-11]。前期研究中我们发现HBV患者中Th17细胞含量高于健康志愿者[12]，这与国内外多数研究结果相似[2，13]。值得注意的是，我们还发现分泌IFN-γ的Th17细胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病阶段存在差异，可能在HBV发生、发展过程中发挥重要作用，且与慢性乙型肝炎患者病情的进展呈正相关[12]。本研究中我们也发现HBV患者中Treg细胞含量高于健康志愿者，且与HBV感染的慢性化有关。

总之，血清IL-35和外周血Treg细胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病阶段存在差异，可能在HBV发生、发展过程中发挥重要作用。HBV感染患者IL-35和Treg细胞亚群的检测，更能使我们正确、充分、全面地了解慢性HBV的发病机制和预后，从而更有效地指导临床治疗。

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Changes and significances of IL-35 and Treg cell in patients with chronic hepatitis B virus.

LIU Zhi-hua,QI Qing-song,ZHANG Zhi-an,ZHANG Xiao-jing.Department of Infectious Diseases,Houjie Hospital of Guangdong Medical College,Dongguan 523945,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the changes and clinical significances of serum IL-35 and Treg cell in patients with chronic hepatitis B.MethodsFourty cases in the Department of Infectious Diseases of Houjie Hospital of Guangdong Medical College with HBV patients were categrized into three group:Group AsC(8 patients with asymptomatic HBV carriers),Group CHB-LM(20 patients with chronic hepatitis B with low and moderate),and Group CSHB(12 patients with chronic severe hepatitis B).The Group HV included 15 healthy volunteers.The serum of IL-35 were measured with Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),Treg cell concentration in peripheral blood were determined by Flow cytometry.Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation of two independent samples.ResultsHBV patients had a significantly higher the level of IL-35[(75.00±6.75)pg/ml]than healthy volunteers[(44.13±4.49)pg/ml].Significant difference was found between two groups(P＜0.05).The levels of IL-35 both on CSHB and CHB-LM group were significantly higher than AsC group(P＜0.05),but the levels of IL-35 between CSHB and CHB-LM group were no significantly difference(P＞0.05).The Treg cell concentration in the periph-eral blood of HBV patients[(6.4±0.42)%]was significantly higher than healthy volunteers[(3.07±0.31)%],the difference of them were statistically significant(P＜0.05).The Treg cell concentration on CSHB group was significantly higher than CHB-LM or AsC group(P＜0.05).The level of serum IL-35 on HBV patients was positively correlated with the concent of Treg cell in peripheral blood(P＜0.05).ConclusionThe changes of serum IL-35 and Treg cell concentration were difference during different disease phases in chronic hepatitis B,they may play a more important role in the occurrence and worsening process of chronic HBV infection.

Treg cell;Interleukin-35;Hepatitis B,Chronic

R512.6+2

A

1003—6350（2014）11—1638—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.11.0634

2014-01-14)

东莞市医疗卫生一般项目（编号：20131051010006）

刘志华。E-mail：jchengtext@126.com