抗宫炎凝胶剂的提取工艺研究

2014-04-01初李佳娃曲海影

中国医药导报 2014年35期

刘玠初李佳娃张迪曲海影常越

1.黑龙江中医药大学研究生学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学附属第四医院静脉用药调配中心，黑龙江哈尔滨 150001

慢性宫颈炎是妇科最常见的疾病之一，也是大多数育龄期妇女的常见病，其发病率高，占妇科门诊总数的40%～60%，是由急性宫颈炎未治疗或治疗不当或非特异性化脓性细菌等病原体长期潜伏于子宫颈黏膜所致，多见于分娩、流产或宫颈术后，是引起盆腔脏器或身体其他器官炎症的潜在病灶。由于病灶部位特殊，临床以局部治疗为主，治疗方法有物理疗法、手术疗法和药物疗法，其中药物疗法因属非创伤性治疗，操作简单方便，对患者要求较低而应用广泛。阴道给药是指药物经阴道黏膜吸收发挥局部或全身作用，避免了肝脏首过效应和胃肠道生理关卡效应，使病灶部位的有效浓度提高，减小药物不良反应，提高生物利用度，增强药物疗效。

本课题研究的新药抗宫炎凝胶剂，原剂型为抗宫炎片，收载于《中国药典》2010 年版一部中，由广东紫珠干浸膏、益母草干浸膏、乌药干浸膏组成，具有清湿热、止带下之功效，临床用于治疗因慢性宫颈炎引起的湿热下注、赤白带下、宫颈糜烂、出血等症效果良好[1]。随着宫颈疾病患病率的不断增高与病灶部位的特殊性，阴道给药制剂成为广大医务工作者的研究热点。除传统的洗剂、片剂、膜剂、膏剂等外，相继出现了例如泡腾片、栓剂、凝胶剂等疗效更好、使用更方便的剂型。凝胶剂与片剂、栓剂相比较患者使用无异物感，顺应性强，是阴道给药治疗宫颈糜烂的一种理想剂型。抗宫炎凝胶剂相比原抗宫炎片，避免了肝脏首过作用和胃肠道生理关卡效应。凝胶基质可与黏膜产生良好的生物相容性，增强黏附性，使病灶部位的有效浓度增加，提高生物利用度，增强药物疗效，且患者使用无异物感，顺应性强[2-4]。既改变制剂的剂型又改变给药途径，属新药研究的范畴，按现行《药品注册管理办法》的七类新药进行研究。因此课题对提取工艺、成型工艺、质量标准及稳定性等进行实验研究，确保新药研发的创新性、可行性[5]。以成型性、细腻性、涂展性、稳定性和溶出度为指标进行凝胶基质筛选；进行方中益母草、乌药、广东紫珠定性鉴别和金石蚕苷高效液相色谱含量测定，制订产品质量标准；考察本制剂的影响因素试验、长期及加速稳定性。相比片剂，凝胶剂对药材提取物干浸膏的要求更高，本实验主要对制剂的提取工艺进行优选，选用正交设计法。参照《中国药典》2010 版一部抗宫炎片项下，分别提取制得广东紫珠干浸膏、益母草干浸膏、乌药干浸膏。通过单因素考察，影响三味药材制得干浸膏的因素一致，本研究依次介绍处方中药味的提取工艺，作为参考。优选醇提工艺条件，为确定该制剂的生产工艺提供实验依据[6-10]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

紫外可见分光光度仪（岛津UV-1601PC）、芦丁对照品（批号：100080-200707）、盐酸水苏碱对照品（批号：110712-201111）、乌药醚内酯对照品（批号：111568-200603）均购自中国药品生物制品检定所。广东紫珠（江西萍乡的广东紫珠规范化种植研究试验基地）、益母草和乌药药材（哈尔滨世一堂饮片厂）；试剂均为分析纯。

1.2 广东紫珠的提取工艺优化

该凝胶剂中，广东紫珠为君药，其总黄酮是具有抗炎镇痛功能的有效成分，研究表明其醇提物对小鼠具有明显的镇痛作用[11-12]。黄酮类成分一般易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂。采用紫外分光光度法测定总黄酮含量和出膏率作为广东紫珠的考察指标。

1.2.1 测定波长的确定

分别取按下述项制得的对照品溶液、供试品溶液各5 mL，置25 mL 容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，放置15 min后加水至刻度，摇匀，照紫外分光光度法，于200～800 nm进行波长扫描。结果测得两种溶液在510 nm 处均有较大吸收峰，故选择测定波长为510 nm。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取于120℃干燥至恒重的芦丁对照品10.11 mg，置于10 mL 容量瓶中，加50%乙醇溶液2 mL，置温水中加热使溶解，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

称取广东紫珠饮片50 g，按各实验设计项下安排提取，提取液滤过，滤液浓缩至200 mL，即得供试品溶液。

1.2.4 总黄酮的测定方法

采用紫外分光光度法测定总黄酮，分别取芦丁对照品溶液及供试品溶液按 “1.2.1” 项下方法显色，在510 nm 处测定吸收度，根据标准曲线方程计算总黄酮含量。

1.2.5 标准曲线的绘制

分别精密吸取“1.2.2”项下对照品溶液0.2、0.8、1.5、2.0、2.5 mL，置25 mL 容量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min，再加氢氧化钠试液10 mL，放置15 min，加水至刻度，摇匀，测定吸收度。以相应的溶液为空白对照。照紫外分光光度法，在510 nm 处测定吸收度，以对照品溶液浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 正交试验设计

以浓度为50%、60%、70%的乙醇溶液为溶剂进行提取。以总黄酮含量和出膏率为指标，对乙醇浓度、提取时间、提取次数、溶剂量4 个因素进行考察，各取3 个水平，选用L9（3）4正交设计表。见表1。

表1 因素水平表（广东紫竹）

1.2.7 工艺验证

按优选工艺进行验证试验（n=3），测得平均干膏得率并对总黄酮的含量进行测定。

1.3 益母草及乌药的提取工艺优化

益母草总生物碱具有明显的抗炎镇痛作用，易溶于水和乙醇中，其中盐酸水苏碱含量高，易于测定，故以紫外分光光度法测定的盐酸水苏碱含量和出膏率作为益母草的考察指标[13-17]。乌药的醇提物具有较强的镇痛抗感染作用，以乌药醚内酯为代表，易溶于乙醇中，故以高效液相色谱法测定的乌药醚内酯含量和出膏率作为乌药的考察指标。

1.3.1 盐酸水苏碱的含量测定

1.3.1.1 含量测定照紫外分光光度法，确定测定波长为520 nm；用0.1 mol/L 盐酸溶液为溶剂，制备对照品溶液与供试品溶液；分别精密量取对照品溶液、0.1 mol/L 盐酸溶液及供试品溶液各10 mL 置25 mL容量瓶中，分别精密加入新制的2%硫氰酸铬铵溶液3 mL，摇匀，加0.1 mol/L 盐酸溶液至刻度，摇匀，置冰浴中放置1 h，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1 mol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法，在520 nm 的波长处分别测定吸收度，用空白试剂的吸收度分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。

1.3.1.2 标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置10 mL 烧杯中，加0.1 mol/L盐酸溶液5 mL，加活性碳0.5 g，置沸水浴加热搅拌半分钟，滤至10 mL 容量瓶中，用0.1 mol/L 盐酸溶液分次洗涤烧杯和滤器，洗液并入同一量瓶中；另取0.1 mol/L 盐酸溶液5 mL 置10 mL 量瓶中。各精密加入新制的2%硫氰酸铬铵溶液3 mL，摇匀，并用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，摇匀，置冰浴中放置1 h，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1 mol/L 盐酸溶液为空白，照分光光度法，在520 nm 处测定吸收度，以吸收度的差值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 乌药醚内酯的含量测定照高效液相色谱法测定。

1.3.2.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（56∶44）为流动相；检测波长为235 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；理论塔板数按乌药醚内酯峰计算应不低于2000。

1.3.2.2 对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的乌药醚内酯对照品10.15 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入色谱甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（浓度为0.406 mg/mL）。

1.3.2.3 供试品溶液的制备精密称取乌药50 g，按各实验设计项下安排提取，提取液过滤，滤液浓缩至200 mL。取其中10 mL 蒸干，加乙醚20 mL 超声处理10 min，挥干，残渣加色谱甲醇溶液溶解定容至10 mL，摇匀，过滤，取续滤液用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。

1.3.2.4 标准曲线的绘制精密吸取上述对照品溶液2.5、3.75、5、6.25、7.5 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加色谱甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。分别精密吸取各对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线

1.3.3 正交试验设计

通过单因素实验考察，选择浓度为85%、90%、95%的乙醇溶液为提取溶剂，以乙醇浓度、提取时间、溶剂量、提取次数4 个因素对益母草的提取工艺进行正交试验；以浓度为75%、85%、95%的乙醇溶液为提取溶剂，对乙醇浓度、溶剂量、提取次数、提取时间4个因素对乌药的提取工艺进行正交试验。选用L9（3）4正交设计表。见表2、3。

表2 因素水平表（益母草）

表3 因素水平表（乌药）

1.3.4 工艺验证

分别对益母草、乌药按优选工艺进行验证试验（n＝3），测得平均干膏得率并对含量进行测定。

2 结果

2.1 广东紫珠提取工艺优化

2.1.1 总黄酮含量测定

芦丁对照品浓度在8.088～101.1 μg/mL 范围内药物浓度与吸收度呈良好的线性关系，回归方程：y ＝0.0112x+0.0025（r ＝0.9999，n＝5）。

2.1.2 正交试验结果

正交试验结果显示：各因素对总黄酮含量的影响大小顺序为：C（提取次数）＞B（提取时间）＞A（乙醇浓度）＞D（加醇量）；各因素三水平之间的趋势为A1＞A2＞A3，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1。直观分析得提取工艺为A1B3C3D2，即醇浓度为50%，加醇量为10 倍量，回流提取3 次，每次3 h。各因素对出膏率的影响大小顺序为：C（提取次数）＞B（提取时间）＞D（加醇量）＞A（乙醇浓度）；各因素三水平之间的趋势为A1＞A2＞A3，B3＞B2＞B1，C3＝C2＞C1，D2＞D1＞D3。直观分析得提取工艺为A1B3C3D2，即醇浓度为50%，加醇量为10 倍量，回流提取3 次，每次3 h。见表4。

2.1.3 方差分析结果

方差分析结果表明：因素B、C 对总黄酮含量有显著影响，因素A、D 对总黄酮含量影响较小；因素C对出膏率有显著影响，其他因素对出膏率影响较小。经多方面考察，以A1B3C3D2组合最佳，即最佳提取工艺为：用50%的乙醇10 倍量，回流提取3 次，每次3 h。见表5。

表4 L9（3）4 正交试验结果（广东紫珠）

表5 方差分析结果（广东紫珠）

2.1.4 广东紫珠提取工艺验证

广东紫珠提取工艺验证结果见表6。广东紫珠总黄酮含量约为6.23%（n＝3），出膏率约为2.49%（n＝3）。验证试验结果与预测值接近，说明该提取工艺稳定可行。

表6 验证试验结果（广东紫珠）

2.2 益母草及乌药的提取工艺优化

2.2.1 盐酸水苏碱含量测定

盐酸水苏碱对照品浓度在0.05～0.25 mg/mL 范围内药物浓度与吸收度呈良好的线性关系，回归方程：y ＝0.502x+0.0341（r ＝0.9997，n＝5）。

2.2.2 乌药醚内酯的含量测定

乌药醚内酯对照品浓度在0.1015～0.3045 mg/mL范围内药物浓度与峰面积呈良好的线性关系。回归方程：y ＝7 770 602.956x+52 654（r ＝0.9991，n＝5）。

2.2.3 益母草提取工艺优化

正交试验结果显示：各因素对盐酸水苏碱含量的影响大小顺序为：D（提取次数）＞A（乙醇浓度）＞B（提取时间）＞C（加醇量）；各因素三水平之间的趋势为A3＞A2＞A1，B1＞B3＞B2，C2＞C1＞C3，D2＞D3＞D1。直观分析得提取工艺为A3B1C2D2，即乙醇浓度为95%，加醇量为10 倍量，提取2 次，每次1.5 h。各因素对出膏率的影响大小顺序为：A（乙醇浓度）＞D（提取次数）＞B（提取时间）＞C（加醇量）；各因素三水平之间的趋势为A1＞A2＞A3，B3＞B1＞B2，C2＞C1＞C3，D3＞D2＞D1。直观分析得提取工艺为A1B3C2D3，即乙醇浓度为85%，加醇为10 倍量，提取3 次，每次2.5 h。见表7。

方差分析结果表明：各因素对益母草中的盐酸水苏碱含量均无显著差异；因素A、D 对出膏率有显著影响，因素B、C 对出膏率影响较小。从提取率和节约能源等方面综合考察，以A3B1C2D2组合最佳，即最佳提取工艺为：10 倍量95%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h。见表8。

2.2.4 乌药提取工艺优化

由乌药提取正交结果可知：各因素对乌药醚内酯含量的影响大小顺序为：B（加醇量）＞A（乙醇浓度）＞C（提取次数）＞D（提取时间）；各因素三水平之间的趋势为A2＞A1＞A3，B1＞B2＞B3，C2＞C3＞C1，D1＞D2＞D3。直观分析得提取工艺为A2B1C2D1，即乙醇浓度为85%，加醇为8 倍量，提取2 次，每次1 h。各因素对出膏率的影响大小顺序为：A（乙醇浓度）＞B（加醇量）＞C（提取次数）＞D （提取时间）；各因素三水平之间的趋势为A2＞A1＞A3，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3。直观分析得提取工艺为A2B2C2D2，即乙醇浓度为85%，加醇为10 倍量，提取2 次，每次1.5 h。见表9。

表7 L9（34）正交试验结果（益母草）

表8 方差分析结果（益母草）

方差分析结果表明：各因素对乌药醚内酯含量均无显著差异；因素A 对出膏率有显著影响，因素B、C、D 对出膏率影响较小。从提取率和节约能源等方面综合考察，以A2B1C2D1组合最佳，即最佳提取工艺为：8倍量85%乙醇回流提取2 次，每次1 h。见表10。

2.2.5 益母草及乌药的提取工艺验证

益母草及乌药的提取工艺结果见表11、12。盐酸水苏碱含量约为0.9955%（n＝3），出膏率约为6.65%（n＝3）；乌药醚内酯含量约为40.912 mg（n＝3），出膏率约为5.06%（n＝3）。验证试验结果与预测值接近，说明优选提取工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 研究意义

由于阴道可容纳的药量较小，因此在保证疗效的基础上，选用出膏率较少的溶剂更有利于达到对药材高度浓缩的目的，有利于后面工作的进一步深入。本实验对于提取溶剂的选择，通过单因素实验考察，均选择出膏率较低的乙醇。

表9 L9（34）正交试验结果（乌药）

表10 方差分析结果（乌药）

表11 验证试验结果（益母草）

表12 验证试验结果（乌药）

3.2 正交试验结果的筛选

本实验中广东紫珠以紫外分光光度法测定总黄酮含量和出膏率为考察指标；益母草采用紫外分光光度法测定盐酸水苏碱含量和出膏率为考察指标；乌药采用高效液相色谱法测定乌药醚内酯含量和出膏率为考察指标。有效成分含量的高低是评价药物疗效的重要因素，考察方中三味药材的有效成分并针对性地进行提取研究。干膏得率也是制剂工艺可行性的重要影响因素，能体现中药制剂的提取情况，是经典的考察指标之一。通过正交试验，优选出三种原料药的最佳提取工艺。

3.3 研究机制分析

通过查阅资料，广东紫珠主要成分为黄酮类化合物，它具有较好的抗菌消炎作用，其外用治疗跌打肿痛、外伤出血、烧伤等症；益母草主要含有益母草碱、水苏碱等成分，具有活血调经、清热解毒之功效[18-19]，由益母草、柴胡、丹皮等中药制成的外用贴剂，治疗盆腔炎效果显著；乌药具有抗病毒、抑菌、抗感染镇痛等药理作用，其外用可使局部血管扩张，缓和肌肉痉挛性疼痛[20-23]。综上所述，三味药外用均具有消炎镇痛的作用。通过对原药材鉴定、提取工艺、成型工艺、质量标准和稳定性的研究，所研制的抗宫炎凝胶剂性质稳定、质量可控、使用方便。本研究不仅符合“三小”、“三效”、“五便”的用药原则，同时为凝胶制剂的研究提供重要的参考依据，也为治疗妇科疾病临床用药的剂型发展开辟了道路。

3.4 研究剂型分析

影响药物阴道吸收的因素有生理因素，药物理化性质和剂型等因素，剂型是药物应用的形式，对药效的发挥极为重要。选择合适的剂型还可以降低或消除药物的不良反应，提高药效。本课题将片剂改为凝胶剂，凝胶剂与阴道黏膜具有良好的偶合和水合作用，可较长时间与病灶部位黏附紧密，能充盈整个阴道，有较好的生物相容性，有利于药物的释放，能更好地发挥疗效，是治疗宫颈疾病较理想的剂型，为本制剂改变原给药途径提供了充分的理论依据[24-26]。

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