RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义

张晓岚

河北省眼科医院耳鼻喉科，河北邢台 054001

喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，恶性度高，易发生局部复发及远处转移，其发生、发展、预后及转移的研究已经成为了耳鼻咽喉-头颈外科的研究热点。细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是在生物进化过程中极为保守的蛋白激酶，研究表明CHK1 在人类许多恶性肿瘤中均有表达，可能与肿瘤的发生、发展及预后有关[1]。 RAD51 基因是细胞DNA 修复系统中的重要组成部分，研究表明RAD51 在人类许多恶性肿瘤中也呈高表达[2]。 本研究应用免疫组织化学方法检测RAD51 及CHK1 在喉鳞状细胞癌组织、对应的癌旁正常黏膜组织及非喉部恶性肿瘤疾病患者的正常黏膜组织中的表达情况，并探讨二者间的关系，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2012 年1～12 月于河北省眼科医院（以下简称“我院”）手术治疗经病理确诊的喉鳞状细胞癌患者50 例， 切取其喉鳞状细胞癌组织及同一患者的癌旁正常黏膜组织50 例。 另收集同期我院手术治疗的非喉部恶性肿瘤疾病（如声带息肉等）患者的喉部正常黏膜组织17 例。 喉鳞状细胞癌患者中男47 例，女3 例；年龄46～79 岁，中位年龄59.5 岁；年龄≤59 岁12 例，年龄＞59 岁38 例；癌肿直径≤2 cm 34 例，＞2 cm 16 例；分型：声门上型17 例，声门型32 例，声门下型1 例；病理学分级：G1+G2级29 例，G3级21 例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期19 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；淋巴结转移者（N+）29 例，无淋巴结转移者（N0）21 例。 非喉部恶性肿瘤疾病患者中男12 例，女5 例；年龄42～76 岁，中位年龄56.2 岁。 喉鳞状细胞癌患者与非喉部恶性肿瘤疾病患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。 本研究经医院伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

采用免疫组织化学二步法。 标本离体后1 h 内采集，置入速冻管，迅速保存于-80℃冰箱内。 将选取的50 例喉鳞状细胞癌组织、对应的50 例癌旁黏膜组织和17 例正常喉黏膜组织常规福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm 切片。实验试剂包括CHK1 兔抗人多克隆抗体、RAD51 兔抗人多克隆抗体、兔二抗免疫组化试剂盒、鼠二抗免疫组化试剂盒、DAB 显色液。 用PBS 代替一抗孵育切片为空白对照。

1.3 结果判定

RAD51 及CHK1 阳性染色是细胞浆中出现棕黄色或棕褐色异染颗粒，周围间质部分有着色为准，其中阳性染色结果的判断标准根据着色强度和阳性细胞百分率采用半定量积分法判断分析结果[3]。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0 对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。 相关性采用Spearman 相关性分析。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义

2 结果

2.1 喉鳞状细胞癌组织、癌旁黏膜组织、正常黏膜组中RAD51、CHK1 阳性率情况

喉鳞状细胞癌组织中RAD51 的阳性率明显高于相对应的癌旁黏膜组织，差异有统计学意义（χ2＝11.235，P ＝0.014）；也高于非喉部恶性肿瘤疾病患者的喉部正常黏膜组织，差异有高度统计学意义（χ2＝12.346，P ＝0.001）。 喉鳞状细胞癌组织中CHK1 阳性率高于癌旁黏膜组织，差异有统计学意义（χ2＝9.235，P ＝0.041）；喉鳞状细胞癌组织中CHK1 的阳性率高于正常黏膜组织，差异有统计学意义（χ2＝11.386，P ＝0.010）；癌旁组织中CHK1 的阳性率高于正常组织，但差异无统计学意义（χ2＝1.245，P ＝0.612）。 见表1。

2.2 RAD51 及CHK1 在喉鳞状细胞中的表达与临床特征的关系

2.2.1 RAD51 在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系 N+的喉鳞状细胞癌组织中RAD51 的阳性率高于N0，差异有统计学意义（P ＜0.05）。RAD51 在Ⅲ、Ⅳ期喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 RAD51 在喉鳞状细胞癌病理分级G1+G2级组织中的阳性率低于G3级，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 RAD51 在吸烟量（支/d×年）＞400 和吸烟量≤400 的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 RAD51 在肿瘤直径≤2 cm 和肿瘤直径＞2 cm的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 RAD51 在喉鳞状细胞癌的临床分型中的声门上型、声门型、声门下型的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 RAD51在喉鳞状细胞癌中年龄＞59 岁和年龄≤59 岁的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 RAD51 在男、女性喉鳞状细胞癌中的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 说明RAD51 的阳性表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关，与吸烟量、肿瘤的大小、临床分型、性别及年龄无关。

表2 喉鳞状细胞癌组织中RAD51 阳性表达与临床、病理特征的关系

2.2.2 CHK1 在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系 CHK1 在有N+的喉鳞状细胞癌组织中阳性率高于N0，差异有统计学意义（P ＜0.05）。CHK1 在Ⅲ、Ⅳ期阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 CHK1 在喉鳞状细胞癌病理分级G1+G2级组织中阳性率低于G3级阳性率，差异有统计学意义（P ＜0.05）。CHK1 在吸烟量（支/d×年）＞400 和吸烟量≤400的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 CHK1 在肿瘤直径≤2 cm 和肿瘤直径＞2 cm 的阳性率分差异无统计学意义（P ＞0.05）。 CHK1 在喉鳞状细胞癌临床分型有声门上型、声门型、声门下型中的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。CHK1 在年龄＞59 岁和年龄≤59 岁的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 CHK1 在男、女性喉鳞状细胞癌组织中的阳性率差异无统计学意义（P ＞0.05）。 说明CHK1 的阳性表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关，与吸烟量、肿瘤的大小、临床分型、性别及年龄无关。见表3。

表3 喉鳞状细胞癌组织中CHK1 阳性表达与临床、病理特征的关系

2.3 喉鳞状细胞癌组织中RAD51 表达与CHK1 表达的关系

经Spearman 相关分析显示喉鳞状细胞癌组织中RAD51 的表达与CHK1 的表达呈正相关（r ＝0.432，P ＜0.01）。 见表4。

表4 喉癌组织中RAD51 表达与CHK1 表达的关系

3 讨论

喉鳞状细胞癌发病的重要机制之一是某些因素破坏了细胞的增殖、修复与凋亡之间的平衡。 研究表明肿瘤细胞的耐药与其逃避凋亡及DNA 的过度修复有关，而细胞的凋亡与细胞周期检测点调节有关[4]。在细胞周期检测点的调节中，CHK1 起着非常重要的作用，RAD51 是体内参与同源重组DNA 修复的关键酶之一[5]。研究发现CHK1 和RAD51 在多种恶性肿瘤中表达均高于正常组织，因此检测喉鳞状细胞癌组织中CHK1 和RAD51 有助于为喉鳞状细胞癌的临床治疗、评估喉鳞状细胞癌预后提供依据。

3.1 RAD51 表达与喉鳞状细胞癌间的关系

人类的RAD51 蛋白主要功能是参与了DNA 双链的修复和重组，在DNA 双链进行链间转移置换时，RAD51 是催化此过程的关键酶。 研究发现RAD51 水平下降降低了同源重组修复DNA 双链的准确性，破坏了其他重组修复途径，使DNA 损伤检查点平衡失调，引起基因组的不稳定，促进了肿瘤的发生，说明RAD51 蛋白表达水平的失调促进了肿瘤的发生、发展[6-9]。 许俊[10]采用免疫组化SP 法检测60 例肺鳞状细胞癌组织RAD51 蛋白阳性率（33.33%）明显高于15 例癌旁正常组织中RAD51 蛋白阳性表达（6.67%）。本研究结果与上述研究一致。 本研究显示：RAD51 在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于癌旁黏膜组织及正常喉黏膜组织，提示RAD51 在喉鳞状细胞癌组织中的高表达可能与喉鳞状细胞癌的发生、发展有关。且RAD51 在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系显示：喉鳞状细胞癌晚期有淋巴结转移时，RAD51的表达增强，低中分化RAD51 的表达增强，而在高分化中的表达相对较弱，病理分化程度越低RAD51 表达越强，说明RAD51 的表达越弱肿瘤的恶性程度就越低。 RAD51 还在有淋巴结转移组中有着高表达，提示它可能影响了肿瘤的转移，RAD51 表达越高预后越差[13-14]。

3.2 CHK1 表达与喉鳞状细胞癌之间的关系

CHK1 是一种调控基因，主要参与了细胞周期中G2/M 期的调控。 当细胞的DNA 双链发生损伤后，CHK1 激活一系列过程，导致细胞周期阻滞。 它同时还激活了DNA 损伤的修复系统， 最终维护细胞的稳定性，从而使细胞能够正常的增殖分化，避免了细胞的凋亡[15-16]。 本研究结果表明：CHK1 在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于癌旁黏膜组织及非喉部恶性肿瘤的正常黏膜组织，但后二者表达无差异，提示CHK1 在喉鳞状细胞癌组织中高表达可能与喉鳞状细胞癌的发生、发展有关。 申帅[17]的研究表明CHK1蛋白表达有随Dukes 分期提升而提高的倾向，癌组织与癌旁正常组织中CHK1 蛋白的表达有显著差异，提示CHK1 与结肠癌的发生发展及预后有密切关系。本研究CHK1 在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系显示：喉鳞状细胞癌到了晚期有淋巴结转移时，CHK1 的表达明显增强，在低中分化中CHK1 的表达增强，而在高分化中的表达相对较弱，病理分化程度越低CHK1 表达越强，说明CHK1 表达越强肿瘤的恶性程度就越高。 CHK1 还在有淋巴结转移组中明显高表达，说明它可能会影响肿瘤的转移，而有转移的肿瘤预后较差，进一步说明了通过监测CHK1 的表达可能可以预测肿瘤的预后。

3.3 RAD51 及CHK1 在喉鳞状细胞癌中二者表达的相关性

本研究发现RAD51 及CHK1 在喉鳞状细胞癌组织中均为高表达，且RAD51 及CHK1 间呈正相关，但具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，RAD51 及CHK1 共同参与了喉鳞状细胞癌的发生及发展过程，二者可以作为恶性肿瘤的分期分级和判断恶性程度的标志，研究其表达可以为肿瘤患者的预后提供依据。

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