黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

刘 毅 李志樑 江腾春 傅 强

1.广州市从化区中医医院内一科，广东广州 510900；2.南方医科大学附属珠江医院心血管内科，广东广州 510280

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由多种致病因素作用于机体导致胰岛功能减退和胰岛素抵抗等引起的一种代谢紊乱综合征，临床上以高血糖和糖尿为主要特征，典型DM 患者可出现多饮、多尿以及消瘦等症状。 DM 的慢性并发症不仅严重影响了患者的生活质量，更是导致其伤残、死亡的主要原因。已有相关研究报道DM 并发症的病理生理学改变主要是源自微血管病变和大血管病变，并且血管内皮损伤是DM 血管病变的始动环节和病理生理基础[1]。 黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中药黄芪中的主要活性成分，既往体外实验[2-3]揭示其具有促进血管内皮祖细胞增殖以及改善内皮功能等作用，从而可能有效干预DM 血管内皮损伤的发病过程。本研究是通过短期内给予2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者足疗程APS 治疗， 从而探讨APS 对T2DM 患者外周血内皮祖细胞 （circulating endothelial progenitor cells，cEPCs）数量及功能的影响。 旨在为APS 在DM慢性并发症的临床治疗中提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象的选择及排除标准 选择2013 年10月～2014 年5 月间在广州市从化区中医医院内一科住院治疗且确诊为T2DM 的患者69 例，分为APS 治疗组（36 例）和常规治疗组（33 例）。 T2DM 诊断参照1999年WHO 诊断标准。 排除标准：高血压、糖尿病等慢性疾病控制不佳；合并糖尿病并发症；合并结缔组织疾病、心血管系统疾病等影响EPCs 的因素；既往有他汀类药物降脂治疗史；炎症、近期外伤、手术史；对黄芪多糖皮试阳性。 本实验均征得患者本人书面同意。 所有研究过程均经医院伦理委员会审查通过。

1.1.2 药物干预 APS 治疗组在普通西药降糖治疗的基础上，每日通过静脉滴注途径加用注射用APS（商品名：伯恩，国药准字220040086，天津赛诺制药有限公司）250 mg，疗程为2 周；常规治疗组仅给予常规西药降糖治疗。 为防止受试患者因既往使用APS 对研究结果产生影响，需确保所有入选受试者在参与研究前1 个月内均无使用APS 治疗。

1.2 材料与试剂

本研究全部实验依托于南方医科大学珠江医院心血管实验室完成。 实验所需材料及试剂包括：人纤维连接蛋白（human fibronectin protein，HFN），购自美国BD 公司；Transwell 小室， 购自美国康宁公司；Dil标记乙酰化低密度脂蛋白（Dil-AcLDL），购自美国Invitrogen 公司；胎牛血清，购自美国Gibco 公司；EGM-2MV 培养基，购自瑞士LONZA 公司；二苯基四氮唑溴盐 （MTT） 以及FITC 标记荆豆凝集素Ⅰ （FITCUEA-Ⅰ），均购自美国SIGMA 公司；单个核细胞分离液，购自天津灏洋生物制品公司；Hanks 平衡盐溶液，购自北京索莱宝科技公司；胰蛋白酶、青-链霉素，均购自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 方法

1.3.1 EPCs 的分离与培养 对入选参与研究的病例均于清晨空腹状态下采集外周血10 mL，肝素抗凝后加入Hanks 平衡盐溶液1∶1 混匀，沿试管壁缓慢加入20 mL 单个核细胞分离液，使用水平离心机（德国Eppendorf 公司） 以2000 r/min 离心20 min 后获取所需要的单个核细胞并使用PBS 洗涤2 次， 经调整细胞悬液浓度后， 将单个核细胞接种于包被有HFN 的培养板上，加入EGM-2MV 培养基（含20%胎牛血清以及青霉素、链霉素各100 U/mL）培养EPCs。

1.3.2 EPCs 的鉴定 换液培养至第7 天，使用PBS 洗掉非贴壁细胞后，将细胞爬片与Dil-AcLDL（24 μg/mL）于37℃条件下孵育1 h， 用倒置荧光显微镜 （日本Olympus 公司）观察EPCs 对Dil-AcLDL 的摄取。确定染色效果后用2%多聚甲醛固定细胞10 min，固定后用PBS 浸洗，加入FITC-UEA-Ⅰ（10 μg/mL）继续于37℃条件下孵育1 h。 通过共聚焦显微镜（LSCM，德国Zeiss 公司）鉴定Dil-AcLDL 和FITC-UEA-Ⅰ双染色阳性细胞即为正在分化的EPCs。 采用倒置荧光显微镜对随机选择的5 个视野进行EPCs 计数。

1.3.3 EPCs 黏附功能检测 使用0.25%的胰酶消化收集培养的贴壁细胞， 用EGM-2MV 培养液吹打均匀，计数并调节细胞浓度。 将等量EPCs 接种于包被有HFN 的培养板上，于细胞培养箱中继续培养30 min，然后随机选取3 个显微镜视野计数贴壁细胞。

1.3.4 EPCs 迁移功能检测 收集贴壁EPCs 用于制备细胞悬液，将Transwell 小室（上室与下室间以8.0 μm孔径的硝酸纤维膜分离开） 每下室分别加入600 μL的EGM-2MV 培养液， 并将100 μL 的EPCs 细胞悬液加入上室。将加入EPCs 的Transwell 小室放入细胞培养箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，经PBS 清洗后，用棉签去除微孔膜上层的细胞。用4%多聚甲醛固定已侵入并贴附于微孔膜下层的细胞，Giemsa 染色后随机选择3 个显微镜视野进行计数， 用于评价EPCs 的迁移能力。

1.3.5 EPCs 增殖功能检测 采用MTT 法检测EPCs增殖能力。首先制备细胞悬液并计数，将等量的EPCs悬液接种于96 孔板培养， 每孔100 μL 并加入MTT（5 g/L）20 μL，于细胞培养箱培养4 h。 之后取出弃上清液，向每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，于微量振荡器振荡10 min 使结晶物充分溶解， 然后置全自动酶标仪于波长490 nm 处测定各孔吸收OD 值，用于评价EPCs 增殖能力。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件进行数据分析， 计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs 的鉴定

由分离获取的单个核细胞培养7 d 后在显微镜下观察细胞呈梭型。 通过共聚焦显微镜鉴定Dil-AcLDL（红色，激发波长为543 nm）和FITC-UEA-Ⅰ（绿色，激发波长为477 nm）双染色阳性（呈黄色）细胞即为正在分化的EPCs（图1，见封三），于倒置荧光显微镜下随机选择5 个视野（倒置荧光显微镜，200×）进行计数并比较。

2.2 APS 对T2DM 患者cEPCs 数量及黏附功能、迁移功能、增殖功能的影响

两组患者在治疗前cEPCs 的数量及功能差异均无统计学意义（P ＞0.05）；常规治疗组在治疗前后cEPCs的数量及功能无明显改变（P ＞0.05）；APS 治疗组患者经过为期2 周的疗程后，cEPCs 的数量显著增加且cEPCs 各功能均明显改善，与治疗前及常规治疗组治疗后比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见表1。

表1 治疗前后两组cEPCs 数量及黏附功能、迁移功能、增殖功能比较（）

表1 治疗前后两组cEPCs 数量及黏附功能、迁移功能、增殖功能比较（）

注： 与本组治疗前比较，*P ＜0.05； 与常规治疗组治疗后比较，#P ＜0.05；APS：黄芪多糖；cEPCs：外周血内皮祖细胞

组别cEPCs 数量（个/HP）黏附细胞（个/HP）迁移细胞（个/HP） 增殖功能APS 治疗组（n=36）治疗前治疗后常规治疗组（n=33）治疗前治疗后35.16±9.23 46.63±9.22*#17.33±7.52 23.28±8.43*#10.36±9.23 15.96±9.56*#0.323±0.082 0.486±0.085*#34.78±8.09 37.56±9.82 16.98±9.12 18.21±10.79 10.01±7.67 10.43±10.38 0.319±0.073 0.339±0.097

2.3 不良反应

两组患者在研究进行过程中，均未有严重不良反应。个别患者使用后出现皮肤红斑、瘙痒、荨麻疹等过敏反应，但短期内均可自行消失。

图1 培养7 d 后EPCs（倒置荧光显微镜，200×）

3 讨论

近年来T2DM 的发病率呈逐年增高趋势，DM 作为一种严重危害人体健康的慢性疾病，已成为世界性公共问题， 其血管病变导致的并发症不仅严重影响DM 患者生活质量， 并且是DM 患者致死致残的主要原因。 有相关报道表明约70%的T2DM 患者死于DM血管并发症。 EPCs 是一类能增殖并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞， 可增加缺血组织新生血管形成，并能够促进损伤内膜的再内皮化，在修复受损内皮并维持正常的内皮功能方面起着极为重要的作用。目前已有研究揭示血管内皮损伤是DM 血管病变的重要始动环节[1]。 而DM 损伤内皮功能的主要病理生理学机制是高血糖及其氧化代谢产物抑制血管内皮NO 生成[4]，抑 制EPCs 分 化 并 促 其 凋 亡[5]，EPCs 受 损后释放大量炎症因子介导血管内膜的炎性反应[6]。

黄芪是由豆科植物蒙古黄芪及膜夹黄芪的干燥块茎入药，其味甘，性微温，归肺脾二经，中医治疗上具有补气升阳、益卫固表、利尿脱毒以及敛疮生肌等功效。 作为一味药用历史悠久的传统补益类中药，目前临床上常用于糖尿病、冠心病等慢性疾病的中医辅助用药。APS 是从中药黄芪中分离提取出来的一种大分子化合物，具有较强的生物活性，是黄芪的主要活性成分之一，具有降低血脂、抗动脉粥样硬化以及调控血糖等作用[7-9]。 有相关动物研究揭示APS 可改善DM 的物质代谢以及延缓DM 慢性并发症的病程[10]。

徐寒松等[11]在体外实验中证实，一定浓度范围内APS 对DM 患者EPCs 的增殖具有促进作用， 且与APS 剂量、使用时间呈依赖关系，其具体作用机制可能是通过PI3K/Akt/eNOS 信号途径达成[12]。 同时APS能够促使EPCs 分泌血管内皮生长因子[3]参与受损血管内皮再生。 提示APS 参与血管内皮损伤修复，并且可以促进EPCs 增殖及分化。

本研究通过对比APS 治疗组在西药降糖的基础上短期加用足疗程APS 治疗及常规治疗组的单纯降糖对症治疗在T2DM 患者中的作用。 研究结果证实，短期足疗程APS 治疗可以显著增加T2DM 患者cEPCs 的数量，同时也能够显著改善其cEPCs 的黏附能力、迁移能力、增殖能力，与常规治疗相比，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。

综上所述，血管内皮损伤在T2DM 合并血管病变的慢性并发症中扮演着重要角色，而T2DM 患者短期足疗程使用APS 治疗可明显增加其cEPCs 的数量且伴随着cEPCs 功能的显著改善， 为短期APS 治疗在T2DM 患者慢性并发症的应用上提供了初步依据。 但APS 改善DM 患者cEPCs 数量及功能的具体作用机制，仍有待于进一步的探讨和研究。 同时由于本次研究的样本量相对较少，尚需增加样本量使研究结果更确切。

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