NF-κB信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及中药有效组（成）分的干预研究

邓冰湘，卢金冬

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学2012级硕士研究生班，湖南 长沙 410208）

NF-κB信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及中药有效组（成）分的干预研究

邓冰湘1，卢金冬2

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学2012级硕士研究生班，湖南 长沙 410208）

脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是一种机制复杂的级联反应性疾病，在其机制中炎症反应最为关键。核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）信号通路作为炎症反应的主要环节，通过调节多种细胞因子及下游基因表达启动炎症反应与细胞凋亡。目前研究显示，部分中药有效成分对CIRI具有保护作用，为明确中药有效成分在CIRI中的作用机理，就近年来NF-κB信号通路在CIRI后炎症反应及细胞凋亡方面可能相关作用作一综述。

脑缺血/再灌注损伤；核因子-κB；炎症反应；中药有效成分

脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是指脑血流中断或大量减少后血流再通时引起的脑组织损伤进一步加重的现象。CIRI为临床常见疾病及多发病，是首位致残因素，且其发病率、病死率及致残率有逐年上升趋势，其中缺血性脑血管病占绝大部，为目前三大致死性疾病之一[1]。目前对CIRI发病机制还不明确，影响缺血/再灌注的主要病理机制是炎症反应和细胞凋亡。脑缺血/再灌注后脑组织细胞受多种因素刺激，激活核因子-κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）信号通路，并调控多种炎症因子及凋亡基因的转录，参与炎症级联反应及细胞凋亡等病理过程[2]。因而中药有效成分通过干预NF-κB信号通路，调节相关因子及基因表达有可能减轻CIRI[3]。为明确中药有效成分在CIRI中的作用机制，就近年来NF-κB信号通路在CIRI后炎症反应及细胞凋亡方面可能相关作用作一综述。

1 NF-κB生物学特性

NF-κB是在B淋巴细胞中检测到的能与免疫球蛋白κ轻链基因特定序列特异性结合的核因子，广泛存在于真核细胞内，参与多种基因的转录调控，其与炎症级联反应及细胞凋亡密切相关[4-5]。

NF-κB的生物活性细胞处于静息状态时，NF-κB／Rel家族与其抑制蛋白 （inhibitor of nuclear factor kappa-B，IκB）结合，以无活性状态的三聚体形式存在于细胞质内。脑缺血/再灌注后，细胞受到某些细胞因子、氧化应激及内毒素等细胞外信号刺激，可通过 I-κB激酶 (inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)激活信号转导通路，导致IκB磷酸化、泛素化及降解，IκB与NF-κB解离，暴露出Rel蛋白上的结合位点，促使NF-κB快速易位进入核内，与DNA特定序列结合，诱导相关基因转录和表达，从而激活炎症因子及细胞因子，导致缺血后炎症反应的发生[6]。

NF-κB诱导表达的靶基因有：（1）细胞因子：包括肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8及E-选择素（E-election）等。（2）细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)[7]。（3）病毒蛋白：急性期蛋白、热休克蛋白（Heat Shock protein，HSP）70、血管紧张素等[8]。（4）受体：主要包括组织相容性复合物、血小板激活因子受体、组织因子、免疫球蛋白c轻链。（5）酶：环氧化酶2（cyclo-oxygen-ase，COX-2）、锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）、金属基质蛋白酶 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、cjun氨基末端激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）和一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）[9-10]。（6）趋化因子：单核细胞趋化因子-1。（7）生长因子：粒-巨噬细胞集落刺激因（granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)。（8）参与细胞循环及凋亡的细胞的蛋白：如C-myc基因、p53基因、肿瘤坏死因子受体相关因子1（tumor necrosisfactorreceptorassociated factor1，TNFR1）、TNFR2、凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的c-IAP1、c-IAP2及抗凋亡蛋白（B-cell lymphoma，Bcl）-2、Bcl-xl等[11]。

NF-κB激活后，为防止过度激活，可通过不同形式的信号途径来抑制自身活化，其主要抑制途径有：（1）IκB-α基因的启动子中含多个 κB结合位点，NF-κB活化后，因NF-κB与IκB的亲和力大于其与DNA的亲和力，IκB进入细胞核与NF-κB再次结合，形成新的NF-κB-IκB复合物，则NF-κB从其相应靶基因上脱落，并从细胞核转移至细胞质内丧失活性。（2）1KK催化亚基的c端可自发磷酸化失活，使NF-κB激活通路自动下调。（3）NF-κB也可使某些急相蛋白，如HSP表达增加，可诱导IκB的合成增加或直接与NF-κB结合，阻断NF-κB向核内转移，防止NF-κB的过度激活。（4）由于p50缺乏反式转录激活域，p105的表达增加导致p50／p50构成的同源二聚体蛋白合成也增加，与DNA结合可以抑制NF-κB转录，p50同源二聚体可以通过与p50／p65异源二聚体竞争DNA结合位点降低NF-κB的过度激活[12]。

2 脑缺血/再灌注后的NF-κB信号通路与炎症反应

脑缺血/再灌注损伤是一个快速级联反应过程，包括能量代谢障碍、氧自由基生成增多、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸过量释放、炎性细胞因子及黏附分子释放、凋亡基因激活等多个环节。这些环节紧密联系，互为因果，彼此重叠，形成恶性循环，最终导致脑细胞凋亡或坏死[13]。脑缺血氧化应激损伤后，诱生型一氧化氮合酶 （inducible nitric oxide synthase，iNOS）、COX-2和ICAM-1表达增加。脑缺血时，神经元表达COX-2和iNOS激活小胶质细胞产生大量的活性氧 (active oxygen，ROS)，细胞因受ROS刺激，启动线粒体凋亡途径，破坏线粒体膜的完整性，使线粒体功能紊乱，导致细胞能量代谢障碍及钙超载[14-15]。随着大量活性氧、氧自由基的产生及兴奋性氨基酸的过量释放，刺激脑组织细胞，激活NF-κB信号通路，上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1及VCAM-1等细胞因子表达，介导白细胞与微血管内皮细胞黏附，促使白细胞向缺血区聚集和浸润，释放大量的炎性介质和细胞因子，吸引更多的中性粒细胞聚集、浸润，损伤血管内皮细胞，破坏血脑屏障，加重脑缺血炎症反应，造成恶性循环[16-17]。

由于NF-κB是脑缺血炎症反应的中心环节，通过抑制NF-κB活性，削弱其与DNA的亲和力，IκB进入细胞核与NF-κB再次结合，形成新的NF-κBIκB复合物，则NF-κB从其相应靶基因上脱落，并从细胞核转移至细胞质内丧失活性。目前，已有大量实验研究表明，通过抑制NF-κB信号通路，下调相关因子表达，可减轻CIRI。如脑缺血/再灌注后，活化的NF-κB增加，经过NF-κB抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcys-teine，NAC）处理及TNF-α经预处理可以抑制NF-κB亚单位p65／RelA的磷酸化，阻断ICAM-1上调，结果显示缺血梗死灶明显减少[18-19]。也有相关实验证明，通过阻断阻断NF-κB激活，下调促炎性介质及凋亡基因表达，可发挥脑保护作用。如，在HSP70转基因小鼠局灶缺血再灌注模型中发现，HSP70可诱导IκB的合成增加或直接与NF-ΚB结合，阻断NF-κB激活，可使小胶质细胞免受细胞毒性损害，减轻脑损伤。又如，活化蛋白C（activated protein C，APC）可通过抑制TNF-α或直接调节NF-κB的p50／52亚基，抑制NF-κB的p65亚基结合DNA，下调促炎性介质（如TNF-α等）蛋白mRNA转录水平，来抑制NF-κB炎症反应，发挥抗炎及脑细胞保护作用[20-21]。

3 脑缺血/再灌注后的NF-κB信号通路与细胞凋亡

细胞凋亡是由各种凋亡信号始动，主要与细胞内源性基因酶类、钙超载、caspase信号等因素有关[22]。目前转录因子NF-κB的抗凋亡作用已被广泛认可。许多研究已证实，NF-κB可通过调节凋亡相关基因的表达实现对细胞凋亡的干预，提高神经细胞的存活率。现代研究证明活化的NF-κB与细胞凋亡有密切关系，其参与多种凋亡相关基因的转录调节，具有促进细胞凋亡及抑制凋亡的双向作用[23]。如内毒素通过促进IAP家族蛋白表达，引起血管内皮细胞激活和NF-κB核移位，抑制促炎介质如TNF-α与IL-1β合成，从而抑制血管内皮细胞凋亡[24]。然而，抑制或促进凋亡的用与特定的细胞类型不同的刺激因素作用有关，在细胞凋亡中起着决定性作用的是NF-κB亚单位的种类及数；当c-Rel表达上升时，促进细胞凋亡，若p65过表达时，抑制细胞凋亡[25]。脑损伤后NF-κB在神经元和胶质细胞中广泛激活，诱导神经细胞产生促凋亡蛋白及基因(如，COX-2、iNOS、P53、C-myc、Fas配体等)经过级联反应，最后激活半胱天冬酶（Caspase）导致神经元凋亡[26]。

NF-κB对细胞凋亡的抑制是一个涉及多个信号通路的复杂过程，其主要是通过其下游抗凋亡基因 （Bcl-2家族、c-FLIP家族的XIAP、c-IAP-l、c-IAP-2等）调节位点上的NF-κB的转录激活来实现的，这些基因的产物通过caspase-3和线粒体的上游发挥作用[27]。如在纤维肉瘤细胞中，NF-κB诱导c-IAP-1、c-IAP-2、TNFR1和TNFR2共同表达，促使caspase-3激活细胞色素C，抑制caspase-8活性，阻断细胞色素C释放，从而抑制细胞凋亡；又如在B淋巴细胞中，CD40诱导的抗凋亡途径主要是通过NF-κB上调Bcl-2和Bcl-X表达而发挥作用，如果阻断NF-κB的激活，就会消除上调作用而无法起到抗凋亡作用[28]。

4 中药有效组（成）分对脑缺血再灌注后NF-kB信号通路的干预作用

脑缺血/再灌注是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应，研究发现中药有效成分抗脑缺血/再灌注的作用机制与抑制NF-κB活化有关，抑制NF-κB的活性对CIRI具有明显的保护作用[29]。例如，黄芪提取物及三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）通过抑制NF-κB p65的活化，降低ICAM-1和TNF-α的表达和中性粒细胞粘附，改善细胞氧自由基清除功能，下调Caspase-3表达与上调Bcl-2基因来抑制氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡，控制炎症反应，减轻CIRI[30-31]。又如川芎嗪通过下调TNF-α诱导NOS的表达，抑制IKK，使NF-κB的表达失活；胡黄连苷Ⅱ可通过下调Toll样受体(toll-like receptor，TLR)4和NF-κB表达；蒲公英提取物通过抑制iNOS、COX-2 mRNA及NF-κB蛋白表达；青藤碱通过抑制 NF-κB活性与 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA的表达，从而抑制其下游基因和细胞因子表达；积雪草酸的可能是通过下调IKK，抑制IκB-α磷酸化、降解，抑制NF-κB的激活，下调iNOS、COX-2、IL-6、IL-1、TNF-α表达；黄芩苷通过抑制NF-κB活化，下调内毒素诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-6的生成，进而来抑制炎症反应及细胞凋亡[32-38]。近来研究表明，中药不同有效成分，通过抑制NF-κB激活，下调不同因子及基因表达，抑制炎性反应及抗细胞凋亡。如雪莲提取物预处理可通过下调CIRI后TLR4表达和抑制NF-κB激活；白藜芦醇通过抑制脑缺血诱导的NF-κB核转位，下调MMP-9基因表达和功能上调，阻止缺血后MMP-9对胞外基质的降解，稳定脑组织内环境，降低脑神经元损伤，发挥生物学保护功能；银杏内酯A可能通过抑制脑缺血损伤后NF-κB表达的激活及p53、Caspase-3的表达，抑制脑神经细胞凋亡[39-41]。

5 结语与展望

脑缺血为临床常见多发性疾病，目前已严重影响人们生活质量及生命安全，其发病机制多为在缺血/再灌注后受多种刺激激活NF-κB转录，启动炎性细胞因子、黏附分子及凋亡基因等表达，促发炎症级联反应及细胞凋亡，从而加剧CIRI。NF-κB过度激活势必加重缺血性脑损伤，因而有必要采取干预措施适当调整。上述大量研究已证实，经中药有效成分干预处理后，其活性可被抑制，进而抑制下游炎症细胞因子、黏附分子及其下游凋亡基因表达，减轻CIRI后炎症反应和神经细胞凋亡。所以，明确脑缺血与NF-κB信号通路相互关系，运用传统中药有效成分配伍组方研究其抗脑缺血是否能起到协同增效作用，为形成组方简单、成分清楚、作用明确，安全高效的新型配伍复方，开发中药在CIRI应用及提高临床治疗缺血性疾病提供新途径和新方法。为进一步明确中药有效成分配伍抗CIRI机制，还需从不同的角度对其进行分析和综合研究。

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（本文编辑 匡静之）

Evaluate the Expression of NF-κB and the Intervene Mechanism of the Traditional Chinese Medicine(TCM)in Cerebral Ischemia Reperfusion

DENG Bingχiang1，LU Jindong2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.2012 Grade of Master Degree Candidate,HUCM,Changsha,Hunan 410208,China)

Cerebralischemia /reperfusion injury is a complex cascade of disease, the mechanism of inflammation is the key.Nuclear factor kappa B (NF-κB)signaling pathway as a main link inflammation,through the regulation of a variety of cytokines and the expression of downstream genes activated inflammatory response and apoptosis.The current study shows that the effective components of part traditional Chinese medicine had protective effect on cerebral ischemia/reperfusion injury.To clear the mechanism of part TCM in cerebral ischemia reperfusion injury,therealated rolesofNF-κB pathway in ischemia/reperfusion injury and inflammatory reaction and apoptosis in recent years were reviewed in this paper.

cerebral ischemia reperfusion;NF-κB;inflammation;active components in TCM

R743

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.014.054.05

2014－03－12

国家自然科学基金青年资助项目（81102557）；湖南省科技厅一般资助项目(2014SK30010)。

邓冰湘，女，教授，博士研究生导师，研究方向：心脏生理学，临床生理学，机能方法学。